生８０４ ＬＥ ＴＴＥＲ Ｖ 。．０‘６ Ｎｏｖ，Ｄ ＯＶ，＾，，ＺＯ１４ 、ｌ斗 ＴＴ ＳＩＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮ０Ｌ０ＧＹ ｏＬＺ３ 技 术 通 讯ｖ ２５ Ｎｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００９～０００２．２０１４．０６．０１２ 研究报告 抗结核分枝杆菌ＲｐｆＢ结构域单克隆抗体的制备及鉴定 樊爱琳，马越云，郑善銮，杨麦贵，郝晓柯 第四军医大学西京医院检验科，陕西西安７１００３２ ［摘要］ 目的：制备抗结核分枝杆菌ＲＤｌＢ结构域单克隆抗体。方法：将ｐＰＲＯ－ＥＸＨＴ—ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ原核表达载体接 种于大肠杆菌ＤＨ５中，用ＩＰＴＧ诱导表达ＲｐｆＢ结构域蛋白，以纯化的ＲｐｆＢ结构域蛋白作为免疫原，皮下包埋免疫小 鼠３次，每次间隔２周；分离小鼠的脾细胞，与Ｓｐ２／０细胞融合，克隆化制备抗ＲｐｆＢ结构域单抗，ＥＬＩＳＡ检测其效价，鉴 定其特异性和相对亲和力，观察制备的抗ＲｐｆＢ结构域单抗对Ｒｐｆ家族其他蛋白的识别能力及其对结核分枝杆菌和藤 黄微球菌的生长抑制作用。结果：制备了３株抗ＲｐｆＢ结构域单抗，特异性高，亲和力较强，均能特异性识别ＲｐｆＢ结构 域。经小鼠腹腔注射制备腹水并纯化，获得了较高纯度的单抗，所制备的抗ＲｐｆＢ结构域多肽的单克隆抗体可以识别 多种Ｒｐｆ样蛋白及其结构域蛋白。在抗体滴度为１：１０００时可有效抑制ＲｐｆＢ结构域对结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒａ和藤黄微 球菌的生长促进作用，提示抗ＲｐｆＢ结构域单抗可能会抑制进入机体内生长停滞或潜伏感染的结核分枝杆菌的再次 激活，可能具有预防隐性感染复发的作用。结论：抗ＲｐｆＢ结构域单抗的制备为进一步研究ＲｐｆＢ结构域的生物学和 免疫特性提供了实验工具。 ［关键词］ 结核分枝杆菌；复苏促进因子；ＲｐｆＢ结构域；单克隆抗体 ［中图分类号］Ｒ３７８．９１ｌ；Ｒ３９２．１１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］ １００９—０００２（２０１４）０６—０８０４－０５ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ０ｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＲｐｆＢ Ｄｏｍａｉｎ ＦＡＮ Ａｉ—Ｌｉｎ，ＭＡ Ｙｕｅ—Ｙｕｎ，ＺＨＥＮＧ Ｓｈａｎ—Ｌｕａｎ，ＹＡＮＧ Ｍａｉ—Ｇｕｉ，ＨＡＯ Ｘｉａｏ—Ｋｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ ７１００３２，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ．Ｅ—ｍａｉｌ：ｈａｏｘｋｇ＠１６３．ｓｏｒｅ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｍＡｂ）ａｇａｉｎｓｔ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＴＢ）ＲｐｆＢ ｄｏ— ｍａｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ｐＰＲＯ—ＥＸＨＴ—ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ｃｔ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ，ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｕｎｄｅｒ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ３ ｔｉｍｅｓ ｗｉｔｈ ２ ｗｅｅｋ ｉｎｔｅｒｖａｌ， ｍｉｃｅ ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ Ｓｐ２／０ ｃｅｌｌｓ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｏｒ ｍＡｂ ａｇａｉｎｓｔ ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ．ＥＬＩＳＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｔｉ—ＲｐｆＢ ｍＡｂ ｔｏ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｒｐｆ ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｍ．ｔｕｂｅｒ－ ｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：０ｕｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｒｅｅ ａｎｔｉ—ＲｐｆＢ ｍＡｂ ｗｅｒｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ｆｕｌｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ．Ａｌｌ ｔｈｒｅｅ ｍＡｂ ｃａｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ｃａｒｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｅｆ— ｆｅｃｔ ｏｆ ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＭＴＢ Ｈ３７Ｒａ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ｍ．１ｕｔｅｕｓ ａｔ １：１０００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ａｎｔｉ— ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ ｍＡｂ ｍａｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｒｍａｎｔ ｏｒ ｌａｔｅｎｔ ＭＴＢ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｙ ｍａｙ ｂｅ ａｂｌｅ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｈｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｏｃｃｕｌｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ—ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ ｍＡｂ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｏｏｌ ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｕｓｉｎｇ ＲＤｆＢ ｄｏｍａｉｎ ａｓ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｆｏｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ—ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ；ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ 结核病是危害人类健康的重要传染病，我国的 数以潜伏感染（休眠菌）的形式存在。现有的抗结核 肺结核患者数量位居世界第二。结核分枝杆菌（Ｍｙ— 药物可以有效杀死处于生长状态的结核分枝杆菌， ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ＭＴＢ）感染人体后，绝大多 但对处在休眠状态的结核分枝杆菌效果甚微。当患 者的抵抗力低下时，休眠的ＭＴＢ就会大量繁殖，重 新处于致病状态 。 收稿日期：２０１４—０５—０７ 基金项目：国家高技术研究发展计划（２ＯＯ７ＡＡＯ２ｚ４７３） 作者简介：樊爱琳（１９７０一），女，博士，副主任医师 通信作者：郝晓柯，（Ｅ—ｍａｉ１）ｈａｏｘｋｇ＠１６３．ｅｏｍ 研究发现，在ＭＴＢ休眠菌的复苏过程中，５种促 进复活因子（ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，Ｒｐｆ）发 樊爱琳等：抗结核分枝杆菌ＲｐｆＢ结构域单克隆抗体的制备及鉴定 ８０５ 挥了重要作用，它们分别为ＲｐｆＡ、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＣ、ＲｐｆＤ 鉴定，采用Ｎｉ“一ＮＴＡ纯化试剂盒按变性条件进行亲 和ＲｐｆＥｐ ，是由ＭＴＢ分泌的。Ｒｐｆ最早在藤黄微球菌 和色谱纯化目的蛋白，采取逐步降低尿素浓度的方 （Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）中被发现 ，它也是发现的第一 法除去尿素，使变性蛋白自然复性。 个能够促使休眠菌恢复生长繁殖能力的分泌型蛋 １．３单抗细胞株的建立 白，是宿主免疫系统识别的靶抗原，其产生的特异性 用纯化的ＲｐｆＢ结构域多肽免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３ 抗体能阻断Ｒｐｆ蛋白对ＭＴＢ休眠菌的复苏作用，因 此Ｒｐｆ蛋白可能是预防和控制ＭＴＢ感染的新途径。 同源性分析发现，在多种富含Ｇ＋Ｃ的革兰阳性细菌 中有Ｒｐｆ样蛋白存在，均具有Ｒｐｆ样结构域 。Ｒｐｆ蛋 次，每次间隔２周；采用ＰＥＧ１５００融合剂，将免疫小 鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞Ｓｐ２／０融合，用含ＨＡＴ的 培养液培养融合细胞５ ｄ，之后改用含ＨＴ的培养液 培养３ ｄ至第８ ｄ，用间接ＥＬＩＳＡ法检测培养上清抗 白结构域是一个含７７个氨基酸残基的截断肽，位于 Ｒｐｆ蛋白全长的Ａ ～Ｌ“。。研究发现Ｒｐｆ蛋白结构域 具有与Ｒｐｆ蛋白一致的生物学功能，其体外复活休 眠菌的作用与完整的Ｒｐｆ蛋白相同，也具有Ｒｐｆ蛋白 相似的免疫原性，诱导产生的特异性抗体可能会阻 断ＭＴＢ的Ｒｐｆ家族的全部Ｒｐｆ样蛋白，抑制细菌的复 苏和生长 ］。ＭＴＢ的５种Ｒｐｆ样蛋白功能重叠 ］，实验 表明敲除其中任何一个Ｒｐｆ基因时，其生长不会受 到明显影响 。这表明ＭＴＢ的５种Ｒｐｆ样蛋白存在 协同作用，共同对ＭＴＢ的休眠进行控制。因此，如 何对其进行优化组合将成为疫苗研发及实验室检测 方法建立的重要障碍。研究表明，ＲｐｆＢ在ＭＴＢ的生 长中发挥较为重要的作用。ＲｐｆＢ蛋白为膜蛋白，具 有多种Ｔ细胞和Ｂ细胞抗原表位，突变ＲｐｆＢ可明显 减缓Ｈ３７Ｒａ的生长速度脚。本实验室前期的研究也 发现Ｓｏｍ具有较强的生物学和免疫学特性 。因 此，ＲｐｆＢ结构域可能是研究ＭＴＢ Ｒｐｆ蛋白免疫学特 性及生物学功能的切入点。为此，我们以原核表达 纯化的ＲｐｆＢ结构域多肽作为免疫原，制备其单克隆 抗体，为进一步研究其生物学和免疫学特性提供了 重要工具。 １材料和方法 １．ｉ材料 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（雌性，６～８周龄）由第四军医大学 动物实验中心提供；结核杆菌Ｈ３７Ｒａ株为陕西省结 核病防治研究所惠赠；藤黄微球菌标准株、大肠杆菌 ＤＨ５ａ为西京医院检验科细菌室保存；Ｓｐ２／０细胞系 由第四军医大学微生物教研室馈赠；ｐＰＲＯ—ＥＸＨＴ— ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ重组质粒为本实验室制备 ；ＰＥＧ、ＨＴ 及ＨＡＴ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；６ｘＨｉｓ单抗、ＨＲＰ山羊抗 小鼠ＩｇＧ抗体购自华美生物公司；Ｎｉ２＋＿ＮＴＡ纯化试 剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。 １．２结核分枝杆菌ＲｐｆＢ结构域多肽的表达和纯化 将ｐＰＲＯ—ＥＸＨＴ—ＲｐｆＢ ｄｏｍａｉｎ原核表达载体接 种于大肠杆菌ＤＨ５，用０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ诱导表达 ４ ｈ，表达的融合蛋白经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹 体效价，将阳性孔用有限稀释法进行克隆化，建立单 克隆细胞株。 １．４含单抗腹水的制备及纯化 将单克隆细胞株细胞密度调至１×１０９－２ｘ１０￣Ｌ， 进行小鼠腹腔注射制备腹水，每只小鼠注射０．５ ｍＬ，注射后１０～１５ ｄ可发现小鼠腹部明显膨大，抽取 腹水，采用正辛酸一硫酸铵法进行纯化。 １．５ 间接夹心ＥＬＩＳＡ法检测纯化抗体效价 用１０ ｇ／Ｌ的ＲｐｆＢ结构域多肽包被板子，加入系 列稀释的纯化抗体，以ＨＲＰ标记的羊抗鼠为二抗， 用ＯＰＤ显色。以Ｓｐ２／０细胞培养上清作为阴性对 照，免疫小鼠血清作为阳性对照。 １．６ Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定纯化单抗的特异性 将表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ后转移至硝酸纤维素 膜上，在３７℃用５０ ｇ／Ｌ脱脂奶粉封闭１ ｈ，加入纯化 的单抗，浓度为１００ ｍｇ／Ｌ，孵育１ ｈ，用ＰＢＳ洗涤３ 次，再加入ＨＲＰ一山羊抗小鼠ＩｇＧ抗体，３７℃摇床孵 育１ ｈ，ＰＢＳ洗涤３次，加入底物，用ＯＰＤ显色。 １．７ ＥＬＩＳＡ法检测单抗的特异性 用ＲｐｆＢ结构域多肽和无关的带Ｈｉｓ标签的融合 蛋白同时包被板子，以纯化的单抗作为一抗，３７℃孵 育１ ｈ，ＰＢＳ洗涤后与１：１０００稀释的ＨＲＰ一山羊抗小 鼠ＩｇＧ抗体３７℃反应ｌ ｈ，ＰＢＳ洗涤，ＯＰＤ显色。 １．８ ＥＬＩＳＡ法鉴定单抗类和亚类 用６种类和亚类特异性羊抗鼠多克隆抗体检测 不含血清的杂交瘤细胞培养上清，呈阳性反应的即 可确定型别。 １．９单抗相对亲和力测定 包被ＲｐｆＢ结构域２ ｍｇ／Ｌ，４￣Ｃ过夜，洗涤后用 １０％小牛血清封闭１ ｈ，加入系列稀释（２００～１０ ｇ／ ｍＬ）的纯化单抗孵育Ｉ ｈ，ＰＢＳ洗涤后与１：１０００稀释 的ＨＲＰ一山羊抗小鼠ＩｇＧ反应１ ｈ，洗涤后用ＯＰＤ显 色，读取Ｄ 值并绘制曲线，观察相对亲和力。 １．１０抗ＲｐｆＢ结构域单抗的交叉实验 分别用藤黄微球菌Ｒｐｆ、Ｒｐｆ结构域、ＭＴＢ ＲｐｆＢ 结构域和ＭＴＢ ＲｐｆＡ、Ｈ３７Ｒａ菌株作为抗原包被板 子，以制备的单抗（选取效价最高的一株Ｂ８Ｇ１１）作 为一抗，用ＥＬＩＳＡ法检测，观察抗ＲｐｆＢ结构域单抗