环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略_刘和.

浙江大学学报 (农业与生命科学版 28(2 : 208~212, 2002

Journal of Zhej i ang Un iversity (A gric 1&L ife Sci 1 收稿日期 :2001204202

基金项目 :浙江省科学技术厅重点资助项目 (001103258 作者简介 :刘 和 (1974- , 男 , 江西吉安人 , 博士生 , 主要 从事环境生物技术的研究 .

文章编号 :100829209(2002 0220208205 环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略 刘 和 , 陈英旭

(浙江大学 环境工程系 , 浙江 杭州 310029

摘 要 :通过对环境污染物的生物降解机制及妨碍污染物降解的因素进行分析 , 提出了几种高效基因 工程降解菌的构建策略 , 包括重组污染物降解基因以优化污染物降解途径 、 重组污染物摄入相关基因以 改善对污染物的生物可利用性和重组环境不利因子抵抗基因以增强其环境适应性等 Λ关 键 词 :生物修复 ; 基因工程菌 ; 污染物降解基因 ; 中图分类号 :X 502 文献标识码 :A

L I U H e , CH EN Y ing 2(t . E ng ineering , Z hej iang U niv . , H ang z hou 310029, Ch ina

Con ies genetically eng i neered bacter i a for env ironm en t biore m edi ation . Journal of Zhejiang U (A gric 1&L ife Sci 1 , 2002, 28(2 :2082212

Abstract :Genetically engineered bacteria ho ld p rom ising po tential in the future app licati ons of bi o rem e 2diati on . T h is paper p resents several constructi on strategies of genetically engineered bacteria fo r the bi o rem ediati on purpo se th rough

analyzing the bi odegradati on m echanis m s of po llutants and encum ber 2ing facto rs fo r efficacy of bi odegradati on . T hese strategies include op ti m izati on of the degradati on path 2w ays , i m p rovem ent of the bi oavailability to po llutants and enhancem ent of the abilities of to lerance to the environm ental hazardous facto rs .

Key words :bi o rem ediati on ; genetically engineered bacterium ; po llutant catabo lic gene ; environm ental

bi o techno logy

受污染环境的生物修复技术是一项蓬勃发

展的环境污染治理技术 , 因其对受污染环境的 生态风险小 、 费用低廉而日益引起各国政府部 门和环境科学研究者的关注 Λ微生物丰富的生 物多样性决定了其代谢类型与污染物降解途径 的广泛多样 , 因此在实际中得到了更多的应用 Λ

然而受微生物对污染物特别是难降解污染物的 降解能力所限 , 生物修复技术具有修复周期长 的明显缺点 , 阻碍了这一技术在现实中的发展 和应用 Λ

构建高效的基因工程菌可以显著提高污染 物的降解效率 [1], 它为解决生物修复周期长等 问题提供了崭新的途径 Λ环境微生物尤其是细 菌中的污染物降解基因 、 降解途径等许多污染 物降解机制的阐明为构建具有高效降解性能的 污染物降解基因工程菌提供了可能 [2]Λ本文通

过对污染物生物降解机制以及阻碍污染物降解 的相关因素进行分析 , 提出几种高效基因工程 菌的构建策略 Λ

1 优化污染物的降解途径

1. 1 重组互补代谢途径

有机污染物在降解菌编码的一系列酶催化 作用下 , 逐步从复杂大分子化合物降解成简单 的无机小分子化合物 Λ一些难降解有机污染物 特别是人工合成化合物 (xenob i o tics 还需要不 同降解菌之间的协同代谢或经共代谢等复杂机 制才能最终得以降解 , 这无疑降低了污染物的 降解效率 Λ因为污染物代谢产物在不同降解菌 间的跨膜转运是耗能过程 , 对细菌来说这是一 种不经济的营养方式 Λ另外 , 某些污染物的中间 代谢产物可能具有毒性或对代谢活性有抑制作 用 , 如不能被迅速代谢利用 ,

谢过程产生抑制作用 Λ 菌降解污染物的种类 、 在显著差异 , 重组 ,

途径组合起来以构建具有特殊降解功能的超级 降解菌 , 可以有效地提高微生物的降解能力 , 从 而提高生物修复效率 Λ

近年来 , 随着对污染物降解机理的逐步阐 明及分子生物学实验手段的飞速发展 , 运用污 染物互补降解途径重组策略已构建出越来越多 的超级降解工程菌 Λ多氯联苯 (PCB s 是自然环 境中广泛存在的一类难降解污染物 ΛPCB s 在 好氧条件下通过细菌 bp h A 基因编码的联苯双 加氧酶催化联苯裂解 , 生成氯代苯甲酸 (CBA 以及异 戊 二 烯 酸 Λ后 者 最 终 降 解 成 CO 2和 H 2O , 但细菌对 CBA 因缺乏相应的降解基因而 不能继续降解 Λ由于 CBA 对联苯双加氧酶具有 强烈的抑制作用 , 使整个 PCB s 的降解效率显 著降低 Λ与此同时 , 某些细菌中发现的脱卤素基 因 , 如 P seud o m onas aerug inosa 142中的 ohb 以 及 A rth robacter g lobif or m is KZT 1中 的 f cb 等 , 它们能迅速脱除 CBA 上的氯 , 使 CBA 顺利 进入后续降解步骤 , 同时也解除了 CBA 对整个 降解途径的抑制作用 Λ因此用脱卤素基因和

bp h 基因构建的重组体 bp h ∷ ohb 弥补了 PCB 的代谢缺陷 Λ

实际上 , 自然界细菌在污染物的选择压力 下相互间的同源基因也存在着遗传交换和重 组 , 以形成新的污染物降解途径 , 但是概率极 低 Λ运用互补代谢途径重组策略可以极大地扩 展细菌的污染物降解范围以及增强细菌对污染 物特别是难降解污染物的降解能力 , 这对于提 高生物修复的效率无疑具有重要意义 Λ

1. 2 改变污染物代谢产物流向

污染物降解过程中由于抑制性中间代谢产 (end 2p p , Λ

, 使抑制性中间产物不 生成或尽快转化 , 从而提高污染物降解效率 Λ例 如 , 苯 、 甲苯 、 二甲苯 (B TX 是环境中常见的石 油化工污染物 , 它们单独存在时被细菌通过 TOL 或 TOD 两种途径降解 , 但两种途径都存 在缺陷 :TOD 途径中 , 二甲苯降解产生的中间 产物 3, 62二甲基邻苯二酚是一截止式代谢产 物 (dead 2end p roduct , 因不能被后续的加氧酶 识别而导致二甲苯降解不完全 Λ而在 TOL 途 径中 , 降解 B TX 的 P . p u tid a m t 22菌体内不 存在识别苯的加氧酶 , 致使苯不能被降解而在 环境中积累 Λ然而研究发现 , P . p u tid a m t 22菌 体内的对甲基苯甲酸脱氢酶能识别 TOD 途径 中经甲苯双加氧酶催化苯降解产生的二羟基二 氢对二甲苯 , 使之得以完全降解 Λ因此 , 可以通 过将 TOD 途径中编码甲苯双加氧酶的基因转 移到 P . p u tid a 的 TOL 途径中 , 利用 TOL 途 径中的脱氢酶来催化 TOD 途径中生成的二羟 基二氢对甲苯 , 使二甲苯不再进入 3, 62二甲基 邻苯二酚途径 Λ这样通过 TOL 和 TOD 途径整 合到一起 , 污染物降解前段利用 TOD 途径 , 后 段利用 TOL 途径 , 通过改变污染物的代谢流 向而将 B TX 完全降解 (见图 1所示 Λ

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第 2期 刘 和 , 陈英旭 环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略

图中实线表示 TOL 途径 , 虚线表示 TOD 途径 , 箭头上的横截线分别表示 TOL 和 TOD Λ缩写说明 :

TDO :甲苯双加氧酶 ; BCG :顺式 21, 22二羟基 21, 22二氢苯 ; XCG :顺式 21, 22二羟基 21, 22XO :二甲苯氧化酶 ; BADH :苯甲醇脱氢酶 ; BALDH :苯甲醛脱氢

酶 ; BA :苯甲酸 ; :; ; BA CG:顺式 22, 32二羟基 22, 32二氢苯甲酸 ; TA CG:顺式 22, 322TA CGDH:顺式 22, 32二羟

基 22, 32二氢对甲基苯甲酸脱氢酶 ; CTL :邻苯二酚 ; 42M ::22, 32双加氧酶 图 F ig . BTX degradati on pathw ay

1. 3 DNA (DNA shuffling 最早 是由 Stemm er 提出的一项对蛋白质进行人工 体外快速定向进化的方法 [3]Λ常规的 PCR 中 , 需要设计特定的引物对选定的 DNA 片段进行 扩增 Λ然而 , DNA 体外随机拼接技术既依赖于 PCR , 又不同于传统的 PCR 技术 Λ这一 DNA

构建策略可以简单概括为重组 、 扩增 、 筛选三个 阶段 , 以上步骤反复进行直至得到所希望的重 组酶蛋白 Λ其一般过程是将一组不同来源的基 因 DNA 或来自同一基因不同突变体的 DNA 经 DNA 酶 随机切割消化 , 获得 DNA 随机酶 切片段混合体 , 以此混合体在不加引物的情况 下进行 PCR 扩增 ΛDNA 酶 切割的 DNA 片 段因相互间的同源性进行随机互补 , 并以此为 引物 , 经 PCR 扩增 , DNA 分子复制 , 从而获得 大量 DNA 不同区域间的随机重组的新 DNA 突变体 Λ完成这一 PCR 随机扩增后 , 再加入特 定引物进行最后的 PCR 扩增 , 便可获得全长基 因的 PCR 产物 Λ将 PCR 产物在寄主细胞中表 达 , 筛选出理想的突变体 , 如此多次循环 Λ由于 同源基因 DNA 体外随机拼接是一项效率极高

的 DNA 重组技术 , 它能够在极短的时间内筛 选出所需要的 DNA 重组蛋白 , 因此这一技术

又被称为蛋白质定向进化技术 Λ这一先进的 DNA 重组策略可以运用于污染物降解基因的 重组 Λ双加氧酶是细菌体内广泛存在的一类多 组分复合酶 , 它们通过将两个氧原子激活 、 加合 到苯环上的方式活化苯环 , 使其进入后续的裂 解开环步骤 Λ由于双加氧酶是催化芳香化合物 降解的一系列酶中最重要的酶之一 , 它对底物 的选择特异性决定了细菌对污染物的降解范 围 , 它对底物的降解效率很大程度上决定了芳 香化合物的降解速率 Λ因此 , 双加氧酶编码基因 应 该 是 DNA 随 机

拼 接 技 术 的 理 想 材 料 ΛB u rkhord eria cep acia LB 400和 P . p seud oa l 2ca lig enes KF 707是两株降解性能迥异的 PCB 降解菌 , 前者的污染物选择范围宽于后者 , 而后 者则对 PCB 同系物中的某些污染物具有更高 的降解效率 Λ尽管如此 , 它们的 PCB 双加氧酶 编码基因 bp h A 1却具有极高的同源性 , 运用 DNA 随机拼接策略将两株菌的 bp h A 1基因重 组 , 筛选后得到的双加氧酶重组体不但具有更 高的降解活性 , 而且还能降解一些其亲本双加

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浙 江 大 学 学 报 (农业与生命科学版 第 28卷

氧酶所不能降解的苯和甲苯类单环芳香化 合物 [4]Λ 2 提高污染物生物可利用性 2. 1 重组表面活性剂编码基因

污染物的生物可利用性与生物修复效果密 切相关 ΛBo s m a 等人认为污染物的生物可利用 性在多数情况下决定了生物修复的可行性及修 复效率 [5]Λ尽管目前的研究结果不尽一致 , 但是 普遍认为 , 表面活性剂能通过改善疏水性化合 物的水溶性和表面张力等理化性质而提高其生 物可利用性 Λ而生物表面活性剂由于具有高表 面活性 、 对热和 pH 值波动的稳定性好 、 低毒性 和生物可降解性而比化学表面活性剂有着更广 泛的应有优势 Λ但由于生物表面活性剂的生产 得率较低 , 因此现在的趋势是利用基因工程的

量 Λ

, 这些工程 Λ而提高 污染物生物可利用性的另一途径是直接对污染 物降解基因和表面活性剂编码基因进行重组 , 然 后转化到合适的宿 主 菌 中 表 达 Λ如 将 从 R hod ococcus ery th rop olis IGT S 8分离得到的脱 硫基因 d sz 转化到产生鼠李糖脂的假单胞菌中 可 使 构 建 的 工 程 菌 的 生 物 脱 硫 效 率 明 显 提高 [6]Λ

2. 2 重组污染物跨膜转运基因

污染物降解速度还与微生物细胞对污染物 的摄取速率有关 , 提高污染物的摄取速度有助 于提高污染物的降解速度 Λ例如 , 许多芳香烃类 化合物进入降解细菌内部需要依靠细胞膜上的 透性酶载体蛋白 , 这类酶蛋白不但对不同的底 物具有特异性 , 甚至对化合物分子的空间构象 也有选择性 Λ因此将这些膜转运蛋白编码基因 重组到污染物降解菌中可以提高其对污染物的 摄取效率 Λ另外 , P . p u tid a 的 42羟基苯甲酸转 运蛋白 Pcak 还具有生物趋化作用 Λ某些降解细 菌中质粒编码的膜转运蛋白 N ahY 对细菌的降 解底物萘也有趋化作用 [7]Λ这些特殊的生物学 现象的发现及其机理的阐明将为构建此类基因 工程菌提供坚实的理论基础 Λ

3 增强细菌的环境适应性 3. 1 增强细菌的抗毒能力

污染物降解菌在生物修复应用中要充分发 挥降解性能就必须提高其对环境毒物的抵抗能 力 Λ许多芳香烃类污染物由于具有高度的疏水 性而易在细菌细胞膜的脂质层积累 , 对细菌产 生毒性 Λ通过对此类化合物具有高度耐受性的 细菌细胞膜结构进行研究后发现 , 构成细胞膜 脂质双层的脂肪酸空间构象全部由顺式转变成 反式结构 , ,

, :细胞内

这些耐受机制促使细菌在高浓度芳香烃类 污染环境下得以生存 Λ由于以上抗毒机制的相 关编码基因已经得到分离 , 因此将污染物降解 基因转入到此类细菌中可构建出对有毒污染物 具有更强耐受力的基因工程菌 , 这将是提高细 菌降解能力的有效途径 Λ

3. 2 增强细菌的放射线耐受性

许多微生物对放射线具有耐受性 , 但目前 分离到的放射线耐受菌多属产芽孢菌 , 而且很 多 还是致病菌 , 因而限制了它们的应用 Λ对

D einococcaceae 属细菌的研究发现 , 它们具有一 些与众不同的特性 , 如繁殖体也具有高活度放 射线耐受性 , 基因在不发生突变的前提下可完 整地表达 , 无致病性 , 易分离培养等 , 这些特性 使其成为最有希望用于放射性环境下进行生物 修复的细菌 Λ因此 , 将污染物降解基因转化到这 类菌体中便有可能构建出耐受放射环境的污染 物降解菌 Λ将 P . p u tid a 中分离得到的甲苯双 加氧酶基因 tod C 1C 2A 转移到 D . rad iod u rans 中 , 构建的工程菌能在高放射性压力下降解甲 苯 、 氯苯以及 3, 42二氯丁烯 [8]Λ另外 , 将编码汞 离子还原酶的 m er A 基因转化 D . rad iod u rans 得到的细菌可在 6000rad h 的放射环境下将 浓度极高的 (30~50Λm o l L H g 2+转化成无 112

第 2期 刘 和 , 陈英旭 环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略

毒 、 易挥发性的 H g 0+[9]Λ与此类似 , 一些其它的 耐受重金属环境及极寒或极热环境条件的相关 编码基因也被克隆分离出来 , 将这些基因与污 染物降解基因重组可得到耐极端环境条件的污 染物降解菌 , 这一构建策略为极端环境条件下 的生物修复提供了可能 Λ

致 谢 :感谢白晓慧博士在本文完成过程中提供的 帮助 Λ References :

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最近 , 浙江大学农业与生物技术学院教授周雪平等先后发现和命名了两种植物新病毒 , 这是为数不多的由我 国科技工作者独立发现和命名的植物新病毒 Λ

据了解 , 周雪平等在对植物 DNA 病毒研究中 , 在云南烟草上分离了多种病毒分离物 , 经生物学 、 血清学及病毒 基因组全序列测定 , 从中发现了两种新病毒 , 遂分别命名为云南烟草曲叶病毒 (Tobacco leaf curl Yunnan V irus 和 烟草曲基病毒 (Tobacco curly shoo t V irus Λ有关结果已先后在 《 A rch ives of V iro logy 》 和 《科学通报》 上发表 Λ据介绍 , 周雪平等曾于 1997年在国际上首次发现植物 DNA 病毒基因组重组可产生新病毒 , 有关研究结果在 国际上引起了广泛关注 Λ目

前 , 他们正在继续开展植物 DNA 病毒基因组结构 、 功能及致病机理研究 Λ该项研究得到 国家杰出青年基金的资助 Λ

— —本刊编辑室 212 浙 江 大 学 学 报 (农业与生命科学版 第 28卷