_肺炎支原体感染的实验室研究进展

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·综　　述·

肺炎支原体感染的实验室研究进展

张雪冬　刘双

　　北京地区成人社会获得性肺炎(CAP)的致病原进行多中心抽样调查,结果显示在被调查的665例CAP中,在610例同时进行了细菌与非典型病原体检测的患者中,肺炎支原体

是最常见的病原体,阳性率为20.7%(126例),其次为肺炎链球菌10.3%(63例)。从上述初步调查结果看,肺炎支原体的感染率已经超过肺炎链球菌,成为CAP的首位致病原。

　　一、肺炎支原体概述　　1　病原学　支原体(mycoplasma)是一类能在无生命的人工培养基中生长繁殖的最小原核型微生物。早在1898年

[1]NocardandRoux就首先从患传染性胸膜炎肺炎的病牛体内

[1]

其他治疗:免疫抑制剂,中药,血浆置换,丙种球蛋白。　　二、MP感染的实验室检查

　　目前国内外MP感染的实验室诊断还没有统一的诊断标准,许多血清学检查和肺炎支原体抗原检测采用各自不同的诊断标准。

　　1　肺炎支原体分离培养:用咽拭子、痰、胸腔积液、肺泡冲洗液进行体外为MP分离培养的标本,是诊断MP感染最可靠的方法,但存在着临床标本中病原体含量少,呼吸道污染的杂菌较多,MP分离培养灵敏度低,耗时长,技术要求高,不能满足快速诊断的需求的特点,限制了其临床应用。虽然MP分离培养对临床快速诊断意义不大,但对流行病学调查有重要意义。在国外某地区大量研究中,培养敏感性仅为64%,特异性为97%,而且MP在出现呼吸道感染症状前可持续在呼吸道存在数周至数月,尤其是在儿童。　　2　血清学检查:对于MP感染的诊断,传统上基于血清学检测,但需等到机体产生抗体后才出现阳性结果。MP抗体的检测对临床诊断肺炎支原体感染具有重要的意义,MP-IgM是机体受肺炎支原体感染时最早出现的特异性抗体,它于发病后第7d即可检出,10～30d后IgM类抗体浓度达到高峰,12～16周IgM类抗体效价逐渐降低直至检测不到。通过对MP分离培养、PCR、MP抗体效价等方法比较,MP-IgM类抗体效价≥1∶160时[3]对MP感染的急性期具有诊断价值。MP-IgM类抗体多在初发感染时检测到,部分成人再次感染后几乎检测不到特异性抗体[4]。IgG类抗肺炎支原体抗体较IgM类抗体出现迟,其浓度峰值出现在MP感染症状发生后的第5周。　　(1)补体结合试验(complementfixationtestCFT)　血清效价在1∶64以上或恢复期比急性期有4倍或4倍以上增高有诊断意义。CFT法检测抗MP-IgM和MP-IgG诊断率分别

[5]

为65%和97%。MP与生殖道支原体及嗜肺军团菌有交叉反应,在某些神经系统疾病和急性胰腺炎时可出现假阳性。补体结合试验需要一定的仪器和技术,操作较复杂,不适用于临床常规检测。

　　(2)冷凝集试验　人感染MP后,血清中除出现特异性抗体外,还存在由I抗原刺激机体产生的非特异性IgM冷凝集素。即在4℃条件下可凝集人的O型红细胞或自身洗涤红细胞,在37℃温浴后凝集现象消失。其滴度≥64时肺炎支原体感染有参考意义。庞菊川等[6]对临床上146例疑似支原体肺炎患儿进行MP-IgM和冷凝集素检测,结果MP-IgM阳性122例,冷凝集试验阳性92例;36例非支原体肺炎患儿中,冷凝集试验阳性12例。因此该试验并不特异,其它疾病如腺病毒感染、肿瘤严重贫血也可阳性。肺炎支原体感染的病人仅见有34%～65%呈阳性。一般发病后1周滴度升高,2～4周达

分离到一种微生物,将它命名为胸膜炎微生物(pleuropneumo-nia-likeorganism,PPLO),1967年正式命为支原体,对人致病的有肺炎支原体、人型支原体、解脲脲原体等。肺炎支原体(mycoplasmapneumonia,MP)广泛存在于人、动物及植物体内,无细胞壁,最外层为细胞膜,基本形态呈球形或丝形,长约2～5μm,革兰氏染色阴性。MP含DNA和RNA两种核酸,其基因组为环状双链DNA。

　　2　流行病学　肺炎支原体(MP)主要通过呼吸道传播,可引起支原体肺炎及慢性支气管炎等呼吸道疾病。肺炎支原体流行性较明显,流行年份的发病率约是非流行年份发病率的数倍。MP肺炎每隔3～8年可在军队或社区中流行一次,有时可造成暴发,但其不是院内感染的主要致病原。MP感染无显著性别差异,人类对MP感染有普遍易感性,主要见于儿童和青少年。全年均可发病,但以秋冬季较多。不同地域的气候,包括气温、湿度等均可影响MP感染的流行曲线。　　3　发病机制　MP感染的发病机理仍不十分清楚,以往的研究认为主要是MP在肺组织局部生长繁殖引起的感染性炎症。近年来认为MP感染与体液免疫、细胞免疫均有关,MP感染的儿童细胞免疫功能下降,而体液免疫无明显改变,存在机体免疫反应、免疫逃逸、免疫调节、免疫抑制等。

　　4　临床表现　患者发热咳嗽症状重,而体征表现轻,缺乏特异性。起病缓慢。肺炎支原体肺炎(mycoplasmapneu-moniaepneumonia,MPP)病程一般为3～4wk,有时长达数月。临床诊断支原体肺炎诊断标准:持续剧烈咳嗽,胸部X线表现远较体征显著;白细胞大多正常或稍增高,红细胞沉降率多增快;青霉素、链霉素及磺胺药治疗无效,因此实验室诊断显得尤为重要。

　　5　治疗　MP感染通常具有自限性,对β-内酰胺类抗生素不敏感,临床治疗常选用红霉素、四环素、喹诺酮类等抗生素,目前多主张使用阿奇霉素序贯疗法治疗支原体感染。

作者单位:100029　北京,首都医科大学附属北京安贞医院感染科242

临床肺科杂志　2011年2月　第16卷第2期

　　1　免疫荧光法:取呼吸道感染患儿的鼻咽分泌物进行肺炎支原体抗原检测,采用鼠抗人单克隆抗体(MP单克隆抗

体),异硫氰酸荧光素标记羊抗鼠IgG,在荧光显微镜下观察特异性荧光(黄绿色为阳性)。　　2　聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术:1989年Bernet首次将PCR技术应用于肺炎支原体的诊[11]断。PCR法目标基因引物根据P1蛋白或16SRNA基因设计,引物序列常为MPP1F(5′-GGATGGCAGTTGCTGGC-[12]3′)和MPP1R(5′-AGGGTGTGAAGAGTTGCAAGT-3′)。随着基因检测技术的发展与成熟,采用PCR技术对MP-DNA的检测,此法敏感性高,特异性强,可用于MP感染的早期诊断[13]。实时荧光定量PCR检测技术需特异标记的探针,实验成本增加,价格昂贵,咽拭子MP-DNAPCR法在MP感染早期能够检测到,而血清学检查此时为阴性,特别适宜于2岁以下儿童患者[14]。荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)可直接检测咽部分泌物中肺炎支原体抗原,对于免疫系统尚未发育完善的婴幼儿具有一定的诊断价值,且荧光定量PCR的拷贝数越大越支持MP感染诊断[15],具有很高的特异性、敏感性,可定量动态评估MP患儿治疗情况。缺点:PCR要求操作技术高,仪器设备昂贵,不适合一般实验室开展。　　四、肺炎支原体快速液体培养法

　　利用MP生长代谢产物使培养液体中指示剂颜色发生改变来判断MP生长,标本中的其它支原体和细菌则因培养液中加入了青霉素和醋酸铊均被抑制。谢世营等[16]研究显示,培养法阳性率(39.5%)与PCR法(42.5%)相比基本一致。随机取100例培养法阳性培养液进行PCR定性试验结果均为阳性,说明方法的特异性良好,准确度高。MP快速液体培养法培养MP是目前比较理想的诊断方法,该方法不但方便、快速、准确,而且还可以进行药物敏感性实验,对临床有非常好的诊断治疗指导作用,无需特殊设备,可作为一般实验室诊断MP感染的首选实验。

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[6]　庞菊川,谈意隽,刘英,等.肺炎支原体IGM抗体检测在小儿诊

高峰,6周后逐渐下降,2～3个月后消失。该试验优点是:操作简便,有一定的参考价值。缺点是该试验灵敏度及特异性

较低,不是确定诊断的指标,仅为参考诊断指标。

　　3　明胶颗粒凝集法:Serodia-MycoⅡ(日本富士株氏会社MP抗体检测试剂盒)采用MP体细胞膜成分(mac株)致敏人工明胶粒子制造而成,致敏粒子与人血清中存在的MP抗体发生凝集反应,其检测抗体效价广,从1∶40～1∶20480,

[7][8]

生产厂家推荐结果以≥1∶40判断为阳性。唐丽萍等对205例符合临床支原体肺炎诊断标准的病例用该方法进行了MP-IgM的检测,MP-IgM阳性者为156例,阳性率为76.1%。该法用明胶颗粒作载体,从而消除了许多非特异性反应,血清MP-IgM特异性高,无需特殊仪器设备即可操作,方便快捷,不仅对MP感染具有诊断价值,而且抗体效价高低与MP感染严重程度呈正相关。明胶颗粒凝集法可作为支原体肺炎实验室诊断的常规检测。

　　4　酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbentAs-says,ELISA):可以检测特异性IgM和IgG抗体,检测方法简单,为诊断MP感染的实用和可靠方法。ELISA法采用提纯的肺炎支原体膜蛋白抗原预包被板,检测人血清/血浆中存在的MP-IgM和MP-IgG,以酶标记抗人IgM和IgG单克隆抗体作为标志物。加入底物TMB显色后终止反应,在450nm波长测各孔OD值,OD值的大小与待检抗体含量成正比。对新生儿、婴幼儿及儿童和成人呼吸道MP感染的病程与诊断具有重要的价值。酶免法(EIA)可同时定量检测MP-IgM和

[9]MP-IgG可进一步提高诊断率。据Yoo等学者研究发现ELISA法检测MP-IgM的敏感性和特异性与明胶颗粒凝集法

没有差异,两种方法的检测结果相符合。ELISA间接法用于检测患者急性期和恢复期血清中特异性IgM、IgG抗体,即其敏感度与标本采集期有关,感染初期阳性率39%,疾病后期可达76%,溶血、混浊和脂血样本会干扰该试验。ELISA法操作简便、快速,适合于临床实验室作为MP感染的常规检查。

[10]

Varshney等学者采用ELISA法检测P30蛋白用于诊断MP感染,与ELISAMP-IgM(theSerion)进行比较,研究结果显示其敏感性和特异性分别为78.57%和89.47%,P30蛋白与P1、P116蛋白同样作为MP感染的免疫学诊断相关指标。　　5　MG链球菌凝集试验:MP感染后约1/3病人的血清中可出现能凝集甲型链球菌MG株的抗体,效价在1∶20以上,而病毒性肺炎无此抗体出现,故本试验有助于两者的鉴别。

　　6　金标免疫斑点法(DotImmungogoldMethod,DIM):是根据金标免疫渗滤原理,利用MP抗原采用免疫渗滤技术,检测血清MP-IgM,黄疸、溶血不影响结果判断,该法操作简单快速,但是MP感染时间短或窗口期的标本由于其抗体还不存在或太低,检测结果会出现阴性,有漏诊的可能,不宜用于临床诊断。

　　三、肺炎支原体抗原检测

　　肺炎支原体抗原检测可用于MP感染早期诊断,即用已知的MP抗体检测痰、咽拭子、支气管灌洗液中的MP抗原,或用基因探针检测标本中存在的MP-DNA(PCR法),最常用的标本是咽拭子。临床肺科杂志　2011年2月　第16卷第2期

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[收稿日期:2010-05-24]

(上接第240页)

PI3K/AKT的活化,提示p53和PI3K/AKT通道两者之间是相互制约的关系。

　　本研究应用不同浓度的PI3K/AKT抑制剂Ly294002在体外干预肺腺癌细胞XWLC-05,发现Ly294002可抑制XWLC-05细胞增殖,当Ly294002浓度为50μmol/L及作用48h后,生长抑制作用最大。在光镜下观察,实验组呈现典型的细胞凋亡特征:细胞形态不圆整,细胞核固缩、裂解成质膜包绕的碎片,呈现明显的细胞凋亡形态,且实验组细胞凋亡率高于对照组(光镜下细胞死亡数增加),提示在Ly294002的作用下,细胞出现了明显的凋亡。MTT结果显示:随着Ly294002浓度的增加,对细胞抑制作用逐渐增强,50μmol/L抑制率最大,并在药物作用48h时抑制作用最大。因为XWLC-05细胞倍增时间为32.8h,细胞生长48h以后细胞抑制率降低与细胞再增殖有关。流式实验研究结果表明,实验组细胞阻滞于Gy294002可能有明显的G2/M期,提示L2/M期阻滞作用,使进入S期的细胞减少,阻止细胞进入DNA合成期,从而延缓细胞的增殖过程。同时,p53基因可直接抑制PI3K/AKT通道的活化,诱导G/M期阻滞,如果发现DNA2损伤不可避免,将会启动细胞凋亡的发生,提示PI3K/AKT的活化主要通过促进细胞进入GS期转换来调控细胞1期和G1-周期,并与p53基因的突变有关。尽管形态上实验组和对照组相比细胞凋亡有不同,但统计学无显著性差异。而HowellsLM等[9]在应用Ly294002作用于乳腺癌细胞时,发现其抑制癌细胞增殖与导致细胞凋亡并无直接关系,从一定程度上验证了本实验的结果;当然,这也可能与细胞生物学特性不同及Ly294002的应用剂量和作用时间及肿瘤的分子生物学改变有关。由此,提示50μmol/L浓度和作用48h为Ly294002的最佳作用浓度和最佳作用时间,并为进一步研究Ly294002对肺腺癌细胞的作用提供了较好的参照。

[1]

　　综上所述,选择性PI3K/AKT抑制剂Ly294002对肺癌细

胞有抑制作用,随着作用机制的进一步阐明,PI3K/AKT有望成为肺癌治疗的新靶点。

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[收稿日期:2010-10-22]