β-半乳糖苷酶活性测定方法

β-半乳糖苷酶活性测定（β-galactosidase assays）

1、将过夜培养的菌液按1%接种量到新鲜培养基中培养，待OD600至0.6时取出，放置于冰上；（或可检测不同OD600时，菌的酶活性）

2、取50-100μl 菌液至 1.5 ml 的离心管中，加370-420μl Z buffer；

3、加 20 μl 氯仿和 10 μl 0.1% SDS，振荡混匀，裂解细胞，放置于冰上30分钟；

4、向离心管中加入 100 μl 浓度 4 mg/ml 的 ONPG，混匀后立即置于 30℃反应30-60分钟；

5、待颜色变黄后，加入 250 μl 1 M Na2CO3中止反应，准确记录变色反应的时间；

6、取200μl上清 ，测定 420 nm 和 550 nm 处的吸光度；

7、计算 β-半乳糖苷酶酶活力：

Miller Units = 1,000×[(OD420－1.75×OD550)] / (t×V×OD600)，其中，

OD420和 OD550----显色后的反应液读数；

OD600----用于显色分析的培养液的细菌密度；

t ----显色反应时间(单位 min)；

V ----用于显色分析的培养液体积(单位 ml)。

Z buffer (总体积 100 ml)：

Na2HPO4·12H2O 100mM 3.5814 g

NaH2PO4·H2O 40mM 0.624g

KCl 10mM 0.07455g

MgSO4·7H2O 1mM 0.0246g

β-mercaptoethanol 5.4μl / ml 540μl

加水到总体积 90 ml，待试剂溶解后调 pH 至 7.0，最后定容到 100 ml，4℃储存。

Substrate solution(总体积10ml)----现用现配

Na2HPO4·12H2O 60mM 0.215 g

NaH2PO4·H2O 40mM 0.0624g

ONPG 4mg/ml 0.04g

终止液（100ml）：

Na2CO3 1M 10.6g