ELISA试剂及溶液配制及实验步骤

ELISA试剂及溶液配制之阿布丰王创作

时间：二O二一年七月二十九日 ①包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)

0.75g碳酸钠,1.46g碳酸氢钠,加去离子水定容至500ml. ②0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)

0.2g磷酸二氢钾,2.90g磷酸氢二钠,8g氯化钠,加去离子水定容到1000ml.

③抗体稀释液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2%BSA

0.2gBSA加配好的0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至100g. ④封闭液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)+2.0%BSA

2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100g. ⑤洗涤液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05%Tween-20

将50ulTween-20溶入100ml0.02mol/L磷酸盐缓冲液中,震荡混匀.

⑥显色液：TMB-过氧化氢尿素溶液

A液(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺,TMB):称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中,完全溶解后,加双蒸水至100ml.

B液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液,pH5.0-5.4):称取Na2HPO4·12H2O14.34g,柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水,加0.75%过氧化氢尿素1.28ml,定容至200ml,调pH至5.0-5.4.

将A液和B液按1：l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液. ⑦终止液：2mol/L H2SO4溶液

10ml98%浓硫酸加入60ml双蒸水中,定容至100ml,室温保管. ⑧酶标二抗：HRP标识表记标帜的羊抗兔 IgG,应用时用抗体稀释

时间：二O二一年七月二十九日

时间：二O二一年七月二十九日

液稀释3000倍. 2.2.6 抗血清的分离

收集血液后,去失落针头,缓慢注入已经灭菌的三角烧瓶中,待凝固后用灭菌滴管将血液沿边缘剥离,室温放置1小时,再放入4℃冰箱过夜(不能冰冻,否则发生溶血),使血清充沛析出.第二天取出后以4℃3000r/min离心30min,取上清,分装后-20℃保管备用.

2.2.7间接ELISA法检测家兔抗血清效价 (1)抗原包被

用包被液(0.05mol/L的碳酸盐缓冲液,pH9.6)把抗原稀释为0.01mg/ml,将稀释好的抗原液于每个酶标板孔中加入100μl.把酶标板置入湿盒内,于4℃包被过夜. (2)洗板

弃去包被液,用洗涤液加满所有酶标孔,用纱布和卫生纸包住扣干.1次,末次将水扣干. (3)封闭

在酶联板上每孔加入250μl封闭液(pH9.6, 0.05mol/L碳酸盐缓冲液含2.0%BSA),将酶联板置于湿盒内,4℃孵育过夜.也可37℃孵育2h.

(4)弃去封闭液,洗涤1次同上. (5)加一抗(家兔抗血清)

将免疫小鼠抗血清10μl 加到990μl 的抗体稀释液中制成1:100的抗血清.(于1.5ml的EP管中把持).给酶标板上A行的1号孔加100μl的1:100的血清.给酶标板上A行的2到12孔各加入抗体稀释液100 μl,然后给A组的第二孔加入100μl 1:100的抗血清,吹吸十次后吸取100μl的血清加到第三孔,再吹吸十次取100μl加到第四孔,依次加到第12孔,最后从第十二孔中吸出100μl舍弃.这样每孔均为100μl,经过11次二倍稀释,血清稀释度为1:204800.B、C行同上把持.

时间：二O二一年七月二十九日

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给D行的前两个孔只加入100μl的抗体稀释液做为空白对比,3-4孔加入100μl稀释100倍的阴性血,5-6孔不加抗原,只用封闭液封闭,每孔加入100μl稀释100倍的抗血清作对比.加完后将酶连板放在湿盒内37℃孵育1h. (6)洗涤同上. (7)加酶标二抗

各孔加入稀释倍数为1:3000的酶标二抗（羊抗兔）100μl,37℃湿盒内孵育1h. (8)洗涤同上 (9)显色

每孔各加A,B液50μl后将酶连板放入湿盒内避光3min左右,当阴性对比孔显蓝绿色时终止.终止时每孔加入50μl的2mol/L

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浓硫酸.(10)检测

终止后迅速用酶标仪测定酶连板各孔A405和A450的值.

时间：二O二一年七月二十九日 时间：二O二一年七月二十九日