中国测试
CHINA MEASUREMENT & TESTVol.45 No.8August, 2019
doi: 10.11857/j.issn.1674-5124.2019020063
普洱茶茶梗发酵香料制备及成分对比分析
丁 仡1,2, 李源栋2, 刘秀明2, 夏建军2, 赵 轶3,
李 娟2, 杨 义4, 段焰青2
(1. 湘潭大学化学学院,湖南 湘潭 411100; 2. 云南中烟工业有限责任公司技术中心,云南 昆明 650202;3. 红云红河集团红河卷烟厂,云南 弥勒 652399; 4. 红云红河烟草(集团)有限责任公司,云南 昆明 650202)摘 要: 以普洱茶茶梗为原料,基于烟草中分离获得3株菌株发酵制备烟用香料。采用同时蒸馏萃取结合气相色谱-质谱联用技术对茶梗发酵香料进行提取分析,通过GC/MS成分分析发现发酵物中苯乙醇、植醇、棕榈酸等部分香气成分增加,并采用发酵物对卷烟进行加香评吸,发现对卷烟抽吸感官有着明显的提升。通过烟草分离出来的菌株能对茶梗进行很好的产香并改善卷烟感官品质,该文可为进一步研究发酵香料提供理论参考。关键词: 普洱茶茶梗; 微生物发酵; 烟用香料; 感官评价
中图分类号:TS426 文献标志码: A 文章编号: 1674–5124(2019)08–0067–08
Preparation and composition analysis of fermented flavor of Pu-erh tea stem
DING Yi1,2, LI Yuandong2, LIU Xiuming2, XIA Jianjun2, ZHAO Yi3,
LI Juan2, YANG Yi4, DUAN Yanqing2
(1. College of Chemistry, Xiangtan University, Xiangtan 411100, China;
2. Technology Center of Yunnan China Tobacco Industry Co., Ltd., Kunming 650202, China;
3. Honghe Cigarette Factory, Hongyun Honghe Group, Mile 652399, China;4. Hongyun-Honghe Tobacco (Group) Co., Ltd., Kunming 650202, China)
Abstract: Using Pu-erh tea stems as raw materials, three strains were isolated based on tobacco to preparetobacco flavors. The extraction and analysis of the fermentation of the tea stalks by simultaneous distillationand gas chromatography-mass spectrometry were carried out. The GC/MS analysis showed that some aromacomponents such as 2-phenylethanol, phytol, hexadecanoic acid were increased in the fermentation. The scentof cigarettes contained with fermented material were appraised, and it was found that the cigarette smokingsense was significantly improved. Strains isolated from tobacco can produce a good fragrance for tea stalks andimprove the sensory quality of cigarettes. This test method provides a theoretical reference for further study offermented flavors.
Keywords: Pu-erh tea stem; microbial fermentation; tobacco spices; sensory evaluation
收稿日期: 2019-02-28;收到修改稿日期: 2019-04-02
基金项目: 云南省科技厅项目(2018BA084);2015年云南省技术创新人才项目(2016HB009);云南中烟科技项目(2018CP04)作者简介: 丁 仡(1994-),男,湖南岳阳市人,硕士研究生,专业方向为天然香料开发。通信作者: 段焰青(1973-),男,云南大理市人,研究员,博士,研究方向为天然香料开发。
68中国测试2019 年 8 月
0 引 言
普洱茶是我国特产茶,主要产于云南勐海、勐腊、普洱市、耿马、沧源、双江、临沧、元江、景东、大理等地。普洱茶香气独特,并具有减肥、降血糖、降血脂、防癌、抗氧化等保健功效[1-4]。普洱茶根据不同加工工艺分为生茶和熟茶,渥堆发酵利用其中酶促、微生物和湿热作用使普洱茶发生一系列物理化学变化,改变茶主要成分产生不同特色香味[5-8]。据报道,茶叶中许多香气成分与烟草中的相同或相似;因此,本文通过从烟叶中分离出的菌株对茶叶进行发酵试验,将茶叶提取液作为卷烟添加剂,可与烟香谐调,弥补烟香,增加卷烟烟气香气量,提高香气质,改善抽吸品质,并在一定程度上降低卷烟烟气有害成分[9-11]。茶梗是茶加工过程产生的大量茶废弃物,并未得到充分利用[10],目前利用微生物发酵技术开发烟用香精香料在烟草行业已有较为广泛应用,本文拟通过普洱茶茶梗与烟叶中微生物进行发酵制备香料,采用同时蒸馏萃取-气相色谱质谱联用法(SDE-GC/MS)对不同微生物发酵香料成分进行对比分析,并进行卷烟添加实验,评价其应用效果,实现对普洱茶茶梗综合利用,变废为宝。
1 材料与方法
1.1 材料与设备1.1.1 材料与试剂
普洱茶茶梗,购于市场;枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis (Van3,保藏号:CGMCC No.4091),短小芽孢杆菌Bacillus pumilus (Van35,保藏号:CGMCCNo.3411),长孢洛德酵母Lodderomyces elongisporus(OF-08,保藏号:CGMCC No.6645),3种菌株均收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;二氯甲烷,GR级,由百灵威科技有限公司提供。1.1.2 仪器与设备
Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪+自动进样器(美国安捷伦科技有限公司);万分之一电子天平(瑞士Mettler Tloede公司);10 mL移液器(德国Eppendorf公司);粉碎机(上海比朗制造有限公司);同时蒸馏提取装置;Milli-Q 型超纯水机(美国Milli-pore 公司);BUCHI R-215型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI 公司)等。1.2 方法
1.2.1 发酵处理
选取800 g普洱茶茶梗放入粉碎机粉碎,将样
品粉末分成4份,每份200 g,放入4个2 L的锥形瓶中,加入1 L的超纯水,用密封膜密封放入灭菌锅,在121 ℃的条件下灭菌0.5 h。其中一个锥形瓶为空白,另外3个分别接种3种不同的菌株。将V35(短小芽孢杆菌)、V3(枯草芽孢杆菌)、OF-08(长孢洛德酵母)菌种活化培养成种子液(OD600为18~2.0)并在无菌实验台进行接种,接种量按质量比为2%,150 r/min、37 ℃条件下摇床培养5 d,过滤获得到普洱茶茶梗发酵液[11-13]。
1.2.2 发酵香料制备
将普洱茶茶梗发酵液中加入400 mL 体积分数为80%的乙醇进行加热回流提取2 h后过滤,重复3次,将3次滤液合并,静置1 d取上清液。用旋转蒸发仪于60 ℃蒸馏除去乙醇,留下所得物再用200 mL的95%乙醇静置1 d,取上清液并在60 ℃下减压浓缩,得到发酵香料[14]。1.2.3 同时蒸馏萃取
将普洱茶茶梗发酵香料50 g加入同时蒸馏萃取装置一端的1 L圆底烧瓶中,加入500 mL超纯水、1 mL内标溶液(质量浓度为50 μg/mL萘溶液)及少许沸石,采用电热套在110 ℃下进行加热;装置另一侧是盛有50 mL二氯甲烷的圆底烧瓶,在50 ℃下水浴加热,同时蒸馏萃取4 h。将二氯甲烷溶液收集并用无水硫酸钠干燥12 h,除去水分后过滤,将滤液减压浓缩至1 mL,待GC-MS分析[14]。
1.2.4 色谱/质谱分析方法
色谱条件。DB-5M毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),载气为氦气(纯度为99.99%),流量:1.0mL/min。升温程序:初始温度50 ℃,保持2 min;以3 ℃/min的速率升温至180 ℃;再以10 ℃/min的速率升温至230 ℃,保持10 min。进样口温度:250 ℃,进样量:1.0 μL,分流比:20∶1,溶剂延迟6 min。
质谱条件。离子源:电轰击电离(EI)源;离子源温度:230 ℃;四极杆温度:150 ℃;电离能量:70 eV;传输线温度:280 ℃;扫描范围(m/z):40~450,质谱检索图库:NIST谱库。1.2.5 定量方法
采用GC-MS测定3种菌株发酵普洱茶茶梗香料中挥发性化学成分,通过Nist11图库进行检索确定其组分,扣除柱流失和溶剂残留,利用内标法确定各组分的相对含量。半定量计算目标物相对含
第 45 卷 第 8 期丁 仡,等:普洱茶茶梗发酵香料制备及成分对比分析69
量。方法如下:使用二氯甲烷作为溶剂配制50 μg/mL萘溶液作为内标液[15]。分别称量50 g不同菌株发酵香料同时蒸馏萃取,加入1 mL内标液,测得内标物和目标物的峰面积,通过下式计算得到目标物相对含量[14]:C目标=C内标×A目标50×A内标类4种、酯类4种、酚类5种、酮类8种、酸类5种、其他化合物8种,主要成分为植醇(61.30 μg/g),棕榈酸(56.35 μg/g),芳樟醇(54.01 μg/g),糠醇(53.97μg/g),α-松油醇(42.69 μg/g),香叶醇(27.04 μg/g),苯乙醛(15.17 μg/g),橙花醇(13.78 μg/g)等;V3发酵茶梗香料中鉴定出化合物60种,包括醇类15种、醛类4种、酯类5种、酚类6种、酮类10种、酸类10种、其他化合物10种,主要成分为棕榈酸(89.38 μg/g),植醇(80.94 μg/g),糠醇(77.31 μg/g),芳樟醇(62.91 μg/g),α-松油醇(48.10 μg/g),香叶醇(33.43 μg/g),咖啡因(23.40 μg/g),橙花醇(16.80μg/g)等;OF-08发酵茶梗香料中鉴定出48种化合物,包括烯烃类1种、醇类12种、醛类5种、酯类8种、酚类5种、酮类5种、酸类5种、醚类1种、其他化合物6种,主要成分为苯乙醇(536.95 μg/g),植醇(69.82 μg/g),芳樟醇(54.99 μg/g),α-松油醇(42.50 μg/g),棕榈酸(40.17 μg/g),咖啡因(19.60 μg/g),橙花醇(17.09 μg/g),2,3-二氢苯并呋喃为(13.88μg/g)等。
通过采用不同菌株对普洱茶茶梗进行发酵处理,相比于空白,不同的菌株发酵后产生的香味成分种类和数量都存在一定差异,其特征主要香味成分含量存在明显变化,导致不同的香气及效果,给卷烟加香产生不同评吸感受。其中植醇具有细腻的
式中:C目标——目标物质量浓度,μg/g;
C内标——内标物浓度,mg/L;A内标——内标物峰面积;A目标——目标物峰面积。
2 结果与分析
2.1 普洱茶茶梗发酵香料成分分析
3种不同的菌株发酵及空白对照,通过GC-MS检测得出总离子流色谱图见图1~图4,通过计算分析得出各组分含量,结果如表1所示。
从表1可知,未发酵茶梗香料中鉴定出42种化合物,包括醇类11种、醛类4种、酯类5种、酚类5种、酮类6种、酸类3种、其他化合物8种,主要成分为糠醇(43.03 μg/g),植醇(40.29 μg/g),芳樟醇(37.24 μg/g),α-松油醇(27.67 μg/g),棕榈酸(20.64 μg/g),香叶醇(17.77 μg/g),苯乙醛(11.02 μg/g),橙花醇(10.54 μg/g)等;V35发酵茶梗香料中鉴定出52种化合物,包括烯烃类2种、醇类16种、醛
1 700 0001 600 0001 500 0001 400 0001 300 0001 200 0001 100 0001 000 000强度900 000800 000700 000600 000500 000400 000300 000200 000100 00010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.0045.0050.0055.0060.0065.00时间/min图 1 未发酵普洱茶茶梗对照气相色谱/质谱总离子流色谱图
70
2 700 0002 600 0002 500 0002 400 0002 300 0002 200 0002 100 0002 000 0001 900 0001 800 0001 700 0001 600 0001 500 0001 400 0001 300 0001 200 0001 100 0001 000 000900 000800 000700 000600 000500 000400 000300 000200 000100 00010.00中国测试2019 年 8 月
强度15.0020.0025.0030.0035.0040.0045.0050.0055.0060.0065.00时间/min图 2 V35发酵普洱茶茶梗香料气相色谱/质谱总离子流色谱图
3 600 0003 400 0003 200 0003 000 0002 800 0002 600 0002 400 0002 200 0002 000 000强度1 800 0001 600 0001 400 0001 200 0001 000 000800 000600 000400 000200 000
10.00
15.0020.0025.0030.0035.0040.0045.0050.0055.0060.0065.00
时间/min
图 3 V3菌株发酵普洱茶茶梗香料气相色谱/质谱总离子流色谱图
花香和膏香,其含量增加52.14%~100.89%;棕榈酸具有淡淡的蜡味、增加口感,其含量增加94.62%~333.04%;芳樟醇具有花香、木香、微弱的柑橘香及花甜香味,其含量增加45.03%~68.93%;糠醇具有微弱的发酵香、焦糖香、奶油味和焦甜味,其含量增
加25.42%~79.66%;α-松油醇具有微弱的发酵香、焦糖香、奶油味和焦甜味,其含量增加53.59%~73.83%;香叶醇具有甜香、玫瑰花香、水果味,其含量增加−69.61%~88.12%;苯乙醇具有玫瑰花香及花香味,其含量增加36.55%~1 256.39%。
第 45 卷 第 8 期
1817161514131211强度/1061098765432110.00丁 仡,等:普洱茶茶梗发酵香料制备及成分对比分析71
15.0020.0025.0030.0035.0040.0045.0050.0055.0060.0065.00时间/min图 4 OF-08发酵菌株普洱茶茶梗香料气相色谱/质谱总离子流色谱图表 1 GC/MS对3种不同菌种发酵普洱茶茶梗及空白挥发性成分的定量分析结果
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 910111213141516171819
保留时间/min
6.707 7.041 8.127 8.753 9.021 9.277 10.65611.01512.66813.04513.28114.11 14.31114.63 15.48215.80715.96416.39816.595
名称吡啶(E)-2-戊烯醇N-乙基吡咯
糠醛2-甲基丁酸糠醇苯乙烯2-甲基环戊-2-烯酮四氢噻吩-3-酮
苯甲醛己酸
(E,E)-2,4-庚二烯醛
三甲基吡嗪2-吡咯甲醛苯甲醇苯乙醛N-乙基吡咯-2-甲醛2-乙酰基吡咯苯乙酮
相似度/%
93989997898897959793919797959694978988
相对含量/(μg∙g–1)
空白1.03−−5.733.5743.03−0.25−2.32−−−−7.5511.024.981.66−
1# (V35)3.62−−7.123.9153.97−0.38−4.122.63−0.7−10.4715.176.402.110.88
2# (V3)4.182.440.89.426.5477.31−0.680.454.214.39−−0.3714.2116.21−3.07−
3# (OF-08)−−−−−−7.08−−−−7.99−−10.8510.226.273.10−
72中国测试2019 年 8 月
续表 1 GC/MS对3种不同菌种发酵普洱茶茶梗及空白挥发性成分的定量分析结果
序号202122232425262728293031323334353637383940414243444546474849505152535455
保留时间/min
16.70317.56917.69818.09418.14718.45519.09320.41720.56720.80620.94 21.47521.56821.76622.28622.53622.66423.12823.46823.64123.84123.94524.21525.08625.16525.34825.43825.62426.10926.40126.48627.40927.68827.95128.34128.739
名称
(Z)-氧化芳樟醇5(呋喃型)
芳樟醇二氢芳樟醇2.6-二甲基环己醇
苯乙醇异佛尔酮茶香酮
3,7-二甲基-1,5-辛二烯-3,7-二醇
甲酚α-松油醇
2,6,6-三甲基-1-亚甲基-2-环己烯
2,3-二氢苯并呋喃
橙花醇愈创木醇香叶醇γ-辛内酯(Z)-2-癸烯醛4-乙基愈创木酚
茚酮
(E,E)-2,4-癸二烯醛
吲哚紫丁香酚甲醚4-乙烯基愈创木酚
橙花酸2,6-二甲氧基苯酚
丁香酚橙花酸二氢丁香酚
2-甲基-6-亚甲基-1,7-辛二烯-3-酮
3,4,5-三甲氧基甲苯
茉莉酮α-长叶烯香兰酸(E)-异丁香酚γ-十一内酯(E)-β-紫罗兰酮
相似度/%
949297989995949892949893888692899697939189989397929293979192938889979798
相对含量/(μg∙g–1)
空白5.9137.244.36−4.240.64−−2.5027.67−9.4810.54−17.77−−2.260.80−3.51−3.91−3.89−−−−0.280.53−0.740.60−0.48
1# (V35)7.6154.016.073.045.790.58−1.714.7642.690.8712.9513.78−27.04−−3.511.47−5.08−7.38−4.35−−−−0.410.920.711.440.86−0.59
2# (V3)10.0362.917.15−14.321.311.25−5.1448.10−21.7016.802.8233.43−−5.232.15−7.03−9.551.12−2.301.122.230.740.821.66−2.931.83−1.16
3# (OF-08)7.6954.995.78−536.95−1.26−4.0742.50−13.8817.09−5.401.482.80−−1.47−0.587.200.863.701.08−−−0.350.90−1.641.143.160.81
第 45 卷 第 8 期丁 仡,等:普洱茶茶梗发酵香料制备及成分对比分析73
续表 1 GC/MS对3种不同菌种发酵普洱茶茶梗及空白挥发性成分的定量分析结果
序号5657585960616263646566676869707172737475767778798081
保留时间/min
28.81530.04530.23730.53130.62430.99332.29 32.61832.96333.16635.31236.81837.22338.04738.49238.97239.29939.94139.94940.11740.81142.49242.66342.97843.83444.095
名称
β-紫罗兰酮-5,6-环氧化物
二苯并呋喃二氢猕猴桃内酯
月桂酸橙花叔醇香芹烯酮柏木脑(Z)-茉莉酮酸甲酯顺式-4-羟基-6-十二烯酸内酯
α-杜松醇
相似度/%
9999939391929596989496979392969797989293919899919297
相对含量/(μg∙g–1)
空白1.16−7.86−−−0.41−−−−2.477.45−0.735.0320.640.32−−−0.741.3440.29−−
1# (V35)1.69−7.58−1.513.07−−−1.29−3.167.77−1.047.9856.35−1.57−1.841.011.9761.30−−
2# (V3)2.720.5713.420.672.41−1.100.77−1.74−4.1523.400.371.2310.7289.38−3.69−−1.562.8280.948.172.13
3# (OF-08)2.01−10.550.501.75−0.87−5.031.241.084.4419.60−1.359.3640.171.51−1.38−1.151.8269.82−−
9-芴酮
6,10,14-三甲基-2-十五酮
咖啡因2-十七酮棕榈酸甲酯异植醇棕榈酸棕榈酸乙酯硬脂酸油酸香叶基香叶醇亚油酸甲酯亚麻酸甲酯植醇亚麻油酸油酸
2.2 添加普洱茶茶梗发酵香料卷烟感官评吸
结果
将三种菌株发酵香料分别取0.1 g,用无菌水稀释40倍,均匀喷洒在40 g烟丝上;用密封袋密封后在80 ℃烘箱中放置30 min;以空白烟丝作为对照,将处理组和对照组的烟丝在温度22 ℃和相对湿度60%的恒温恒湿箱中平衡24 h;按常规方法卷成烟支并随机编号后,由专业评吸人员进行感官评吸[16]。参照GB5606.4-2005《卷烟第四部分:感官技术要求》[17]对烟支样品进行感官评价(见表2)。评吸结
果表明:相比对照,普洱茶茶梗发酵香料具有改善烟香、余味,增加甜润感、降低刺激,吸味更加柔和效果,明显提升了卷烟感官抽吸品质。
3 结束语
本文采用从烟叶中分离出来的3种菌株对普洱茶茶梗进行发酵制备香料,结合SDE-GC/MS对普洱茶茶梗发酵香料成分进行对比分析,其中从V35(短小芽孢杆菌)、V3(枯草芽孢杆菌)、OF-08(长孢洛德酵母)普洱茶茶梗发酵香料中分别鉴定出52种、60种和48种化合物,不同菌株发酵普洱茶
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表 2 卷烟感官评吸结果
卷烟样品未发酵香料V35发酵香料V3发酵香料OF-08发酵香料
评吸结果
香气平淡,清香、茶香不明显,刺激性稍有,略有杂气,余味稍有残留烟香协调,清香明显,具有甜香,香韵丰富,无明显杂气刺激性,余味干净舒适烟气细腻和顺,具清甜花韵和茶韵,醇厚甘鲜,香气协调,刺激减小,余味舒适
具有茶香香韵,增加清甜香,提升香气丰富性,烟气细腻柔和、透发飘逸,有回甜感,掩盖杂气、降低刺激、改善口感
茶梗香料中成分含量以及种类有着明显差异。发酵后香气成分相对于未发酵有所增加,最为突出的是OF-08发酵物中苯乙醇相对于未发酵增加了1 256.39%,试验证明OF-08(长孢洛德酵母)能发酵产生大量的苯乙醇。 同时将3种不同发酵香料进行卷烟评吸,相比对照,普洱茶茶梗发酵香料具有改善烟香、余味,增加甜润感、降低刺激,使吸味更加柔和的效果,且不同菌株发酵普洱茶茶梗香料对卷烟抽吸品质改善效果不一样。本研究采用烟叶中分离出来的微生物对普洱茶茶梗进行发酵,产生了大量的致香物质,能很好的改善卷烟的抽吸感,并不会破坏原有的和谐及香气,且成本较低,安全性高,该方法在烟用香精香料中具有较好的工业应用前景。
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(编辑:莫婕)
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