卵清蛋白HP-OVA诱导阴道上皮细胞凋亡的作用及机制

摘要】 目的 研究卵清蛋白（HP-OVA）诱导阴道上皮细胞(VK2/E6E7)凋亡诱导作用及机制。方法 接种VK2/E6E7细胞，分别以不同药物浓度（10、2、0.5、

0mg/ml）进行处理，采用CCK8法检测细胞增殖抑制率，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。结果 随着HP-OVA浓度的升高, VK2/E6E7细胞增殖明显受到抑制，细胞增殖抑制率明显增加, 且当HP-OVA浓度为10mg/ml时，细胞增殖抑制率达68.2%。HP-OVA诱导VK2/E6E7细胞凋亡的作用也很强，具有时间-浓度依赖性。结论 卵清蛋白具有诱导阴道上皮细胞增殖抑制和促进凋亡的作用，是非常理想抗HPV的杀微生物制剂。

【关键词】卵清蛋白HP-OVA 杀微生物制剂 人乳头瘤病毒 增殖抑制 凋亡

尖锐湿疣（CA）是人乳头瘤病毒( human papillomavirus, HPV)感染导致一种性传播疾病，其发病率逐年增加，现已占我国性传播疾病的第二位[1]。人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV) 感染可导致多种疾病，目前已确认与HPV感染相关的疾病除了有尖锐湿疣，还有肛周癌、外阴癌、阴茎癌、口腔癌和子宫颈癌等[2]。目前治疗HPV感染的方法很多，但均有较高的复发率。虽然HPV 预防性疫苗已成功上市，但其仅适用于未感染的年轻人群，对已感染HPV人群不适用，且预防性疫苗的药效持续时间和适用人群的年龄等问题仍有待进一步研究[3]。阴道局部使用的杀微生物剂（Microbicides），为治疗尖锐湿疣提供了一项新的思路和选择。卵清蛋白是由抗HPV活性高、蛋白来源广泛，价格低廉的酸酐修饰蛋白经过蛋白修饰后合成，无诱导阴道炎症形成、损伤阴道黏膜及破环阴道环境的副作用，可作为理想的杀微生物制剂[4]。我们研究了卵清蛋白（HP-OVA）对

VK2/E6E7细胞增殖抑制和凋亡，旨在为开发新一代的杀HPV制剂奠定基础。 1 材料

1.1 药品与试剂

卵清蛋白及VK2/E6E7细胞均由男方医科大学药学院惠赠； 培养基

（Keratinocyte-SFM）、双抗（Penicillin-Streptomycin）；胰酶（TRYPSIN 0.25%）均购自invitrogen；CCK8检测试剂盒购自美国Beytime；TUNEL检测试剂盒购自MERCK公司；PBS液自制。 1.2主要仪器

多功能酶标仪美国MDS公司；正置荧光显微镜 日本奥林巴斯公司 2 方法

2.1检测增殖抑制

2.1.1细胞接种 取对数生长期的VK2/E6E7细胞，消化后调整细胞浓度为25*104/ml。接种于96孔板中，每孔1500个细胞，接种12h后加药处理。

2.1.2 药物处理：以PBS缓冲液作为药物的溶剂；药物终浓度为：10、2、0.5、0mg/ml；处理时间分别为30min、6h、24h；

2.1.3检测方法：利用CCK8检测试剂盒进行检测，每隔24小时检测一次，共检测2个时间点；以酶标仪检测各孔OD值，计算不同浓度药物不同时间对细胞生长的增殖抑制率。增殖抑制率=[1－（给药-本底）/（对照－本底）]×100%。 2.2检测细胞凋亡

2.2.1 细胞接种：同2.1.1

2.2.2 细胞爬片：在35mm培养皿中放置20mm×20mm的盖玻片（经清洗和灭菌处理），接种3×105个细胞，接种12h后进行加药处理；

2.2.3 药物处理：以PBS缓冲液作为药物的溶剂；药物终浓度为：10、2、0.5、0mg/ml；处理时间分别为30min、6h、24 h； 2.2.4 检测方法：TUNEL法

利用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒进行检测，检测的时间点统一为处理后24h、36h。每个样品随机计数4个视野，分别计算凋亡细胞数和总细胞数，按公式计算，凋亡指数(AI)：AI＝凋亡细胞数／(凋亡细胞数十正常细胞数)。 2.3统计学方法

采用SPSS13.0软件进行数据统计，数据以 ±SD表示,两组间均数比较采用独立样本t检验（Independent-Samples T Test），各组间比较采用单因素方差分析（One- Way ANOVA），多重比较采用Bonferroni法。方差不齐时分别采用Welch法和Tamhane’s T2检验。当P<0.05时，差异显著，有统计学意义。 3 结果

3.1增殖抑制率

HP-OVA抑制VK2/E6E7细胞增殖：不同浓度HP-OVA对VK2/E6E7细胞增殖有抑制作用，而且这种作用呈时间-剂量依赖关系，随 HP-OVA浓度增加或作用时间延长，VK2/E6E7细胞增殖抑制率增加，结果见表 1、 表 2。

表1 HP-OVA（10mg/ml）作用于VK2/E6E7细胞不同时间的凋亡率

Tab1 the apoptotic rate were treated with HP-OVA in 10mg/ml for different hours

表2 HP-OVA（10mg/ml）作用于VK2/E6E7细胞72h的凋亡率

Tab2 the apoptotic rate were treated with HP-OVA in 10mg/ml for 72 hours

3.2细胞凋亡率

HP-OVA对VK2/E6E7细胞凋亡率的影响VK2/E6E7细胞经0.5、2、10mg/ml的HP-OVA分别作用 24、36后，用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率（见图1）。结果显示：在一定的浓度范围内 (0-10mg/ml) HP-OVA诱导VK2/E6E7细胞凋亡的作用随着HP-OVA浓度的增加而增强，具有浓度依赖性，并且随着作用的时间延长，HP-OVA的诱导凋亡作用也增强，差异有统计学意义(P<0.000)，结果见表 3。

图1 VK2/E6E7细胞凋亡结果 Fig1 the apoptosis of VK2/E6E7

表3不同浓度及时间的HP-OVA诱导VK2/E6E7的凋亡率(n = 4，x-±s%)

Tab3 the apoptotic percentage of VK2/E6E7 were induced by HP-OVA at different concentrations and times

4 讨论

杀微生物剂是一类含有HPV成分的凝胶、乳脂、栓剂、药膜或海绵，在性交前置入阴道或肛门内，以预防尖锐湿疣、艾滋病和其它性传播疾病的传播。杀微生物剂可通过直接灭活HPV、阻止HPV粘附及侵入阴道或尿道黏膜内的靶细胞、抑制HPV在靶细胞内复制等作用机理，保护健康人群在性行为时免受HPV感染[5]。卵清蛋白（HP-OVA）已证实具有极广谱的抗病毒活性，并且对阴道安全无毒，不会引起免疫反应；加之价格低廉，易于制备保存及稳定等特点，是非常理想的杀微生物制剂。此外，卵清蛋白能和具有开发成杀微生物制剂潜能的抗病毒药物合用，具有提高疗效，减少药物毒副作用的协同效果，这为杀微生物制剂的研发

提供了新的思路。

HPV致病的主要机制就是阻止细胞凋亡、改变细胞转录、扰乱正常的信号转导，从而使细胞发生转化[6]。本研究评估了HP-OVA抑制HPV病毒的活性，结果发现，HP-OVA能明显诱导阴道上皮细胞增殖抑制和促进凋亡，但其具体的作用位点以及卵清蛋白在诱导阴道上皮细胞增殖抑制和促进凋亡的具体机制还不清楚，有待进一步的实验研究。

参 考 文 献

[1]徐文严.临床性病学[M].南京:江苏科学技术出版社,2007, 178-200.

[2]StanleyM1 HPV vaccines [J] 1 Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2006, 20 (2) : 27922931. [3]HarperDM, Franco EL, Wheeler C, etal. Efficacy of a bivalent L1 virus - like partical vaccine in prevention of infection with human papillomavirus types 16 and 18 in young women: a randomized controlled trial . Lancet, 2004, 364 (9447) : 1757 - 1765.

[4]Li L, Tan S, Lu H, et al. Combinations of 3-Hydroxyphthalic Anhydride-modified Ovalbumin with Antiretroviral Drug-based Microbicide Candidates Display Synergistic and Complementary Effects against HIV-1 Infection［J］. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, 2011; 56(5): 384-92.

[5]Balzarini J，Van Damme L. Microbicide drug candidates to prevent HIV infection. Lancet,2007;369(9563):787-97.

[6]Cha X L. Medical Molecular Biology[M].Beiing: People's Medical Publishing House,2003:523.