反义药物药理学的研究进展

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综述与编译

反义药物药理学的研究进展

袁守军　汤仲明综述

(军事医学科学院放射医学研究所　北京　100850)

摘要　反义药物研究在经历了一段低谷后,再次进入了蓬勃发展时期。本文概括了反义药物近几年的发展概况,对其药效学、药代动力学、副作用、应用前景和目前存在的问题进行了较为详细的综述。

关键词　反义药物;药效学;药代动力学1　概述

反义核酸技术是根据核酸杂交原理设计选择性抑制特定基因表达为目的的新技术,有两个应用领域:(1)通过功能丧失分析研究基因的生理和病理功能;(2)开发以治疗为目的之反义药物。其技术手段包括反义RNA、反义DNA、

1〕

核酶和RNA分子陷阱〔。随着快速基因克隆、

耐药基因、周期素(cyclin)、前胸腺素、T细胞受体、粒巨噬细胞集落刺激因子、集落刺激因子-1、表皮生长因子(EGF)受体、󰀁-球蛋白、cAMP-蛋白激酶Ⅱ󰀁、磷脂酶A2和蛋白激酶C

表1　已进入临床试验的反义药物

反义药物ISIS2302ISIS3521GEM132GEM132ISIS2922G3139G3139G3139G3139

靶点(mRNA)

　胞间粘附因子(Crohn病)　蛋白激酶C(卵巢癌)　巨细胞病毒感染　巨细胞病毒性视网膜炎　巨细胞病毒性视网膜炎　非何杰金氏淋巴瘤　急性粒细胞白血病(AML)　慢性粒细胞白血病(CML)　急性/慢性粒细胞白血病　　骨髓清洗术后

ISIS5132(OL1)p53c-mybc-mybc-mycLR-3280GEM91Gps0193AR177ISIS2105C-rafp53c-mybc-myb

　扩张冠脉后再狭窄　扩张冠脉后再狭窄　人免疫缺陷病毒　人免疫缺陷病毒　人免疫缺陷病毒　人乳头瘤病毒ⅠⅠAMLⅠ/ⅡCMLⅠⅠⅡⅠb/ⅡⅠⅠ

Ⅱ期临床后撤消临床试验期

ⅡⅠⅡⅠ/ⅡⅢⅠ/ⅡⅠ/ⅡⅠ/ⅡⅠ/Ⅱ

测序技术及快速自动DNA化学合成技术的出现,反义药物的研究和应用才真正广泛开展。

80年代末到90年代初,人们以病毒、癌基因、细胞活性因子及其他疾病相关蛋白的基因为靶点,进行了一系列的体外和体内实验,许多研究结果表明,反义寡聚脱氧核苷酸类(oligodeoxynucleotides,ODN)有明显的生物学效应。但在1995年以前的报道中,还没有一例降低细胞内相应靶蛋白和靶mRNA的定量资料,仅有关于推断性的反义作用机制的报道。1996年以后,随着对反义ODN药物反义作用机理的阐明,以及一些良好的临床结果的报道,人们对反义疗法又燃起了热情。

目前,选择的反义靶点主要包括

〔4～7〕〔4〕

〔3〕

〔2〕

:(1)

病毒类:人T淋巴细胞病毒、人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、疱疹性口炎病毒、流感病毒、脑炎病毒、SV40、Rous肉瘤病毒、乙肝病毒、牛乳头瘤病毒和巨细胞病毒等;(2)癌基因类:c-myc,c-myb,bcl-2,N-ras,K-ras,H-ras,c-jun,c-fos,cdc-2和c-mos等;(3)宿主基因类:多药・258・ForeignMedicalSciencesSectiononPharmacy　1998Oct;25(5)

8〕

性方面设计了许多衍生物〔,主要包括:(1)改

等;(4)细胞因子类:碱性成纤维细胞生长因子、成髓细胞形成因子(myelo-TAU反应元件、

blastin)、细胞间粘附因子-1、白介素-2、白介素-1󰀂、白介素-1󰀁、IGF-1、穿孔因子(perforin)等;(5)其他:氯霉素乙酰转移酶、TAR驱动的胎盘碱性磷酸酶、人乳头瘤病毒E2反应元件驱动的氯霉素乙酰转移酶。表1列出了已进入临床试验的反义药物。2　药效学

2.1　反义作用

早期的反义药物研究主要是在癌症和病毒感染方面,目前在其他领域中的研究也有了较大进展,如神经系统中细胞和器官培养技术的进展,以及许多神经受体、趋神经性因子、第二信使转录因子的发现和测序,反义核苷酸在脑研究和疾病的治疗方面也有了广泛的应用范围。

2.1.1　反义药物的设计　最初的设计靶点为端,启动密码AUG周围和核糖体mRNA的5′〔8〕

的装配部位。但研究表明,mRNA的其他位置均可成为选择的靶点,尤其是3′端的非翻译

〔9〕

区域。端、3′Monia等选择C-rafmRNA上5′端以及编码区的34个位置作为靶点设计反义药物,结果作用于3′端非翻译区的ISIS5132的活性最强。目前对于选择性的规律还不够清楚,反义药物靶点的选择还比较盲目,处在随机筛选的状况。

反义ODN长度的确定需考虑特异性、生理条件下与互补序列结合的稳定性、能够被RNaseH识别及成本等因素。细胞中一条核苷酸链含有4种不同的碱基,单倍体人基因组约含3×10个碱基。从统计学计算,17～18个碱基序列长度将有一次出现的机会。目前,反义ODN的长度多为15～20个碱基,可在统计上保证其专一性。

ODN是多聚阴离子,不能通过细胞膜,而且易受细胞内外核酸酶的破坏。故在保持特异性、理化特性、透过细胞膜能力以及对核酸酶抗9

变立体构型,由天然的󰀁型糖苷键改为󰀂型;

(2)化学修饰,即ODN磷酸糖骨架的磷酸二酯键被一些化学基团取代修饰,如甲基、乙基和硫等;(3)ODN末端修饰,如连接一疏水基团胆甾醇;(4)肽核酸,用多肽取代磷酸二酯键骨架。其中以硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸(PS-ODN)最为常用,它基本上与天然DNA相同,保留了骨架的负电性变化。主要特点是:有良好的溶解性、杂交性能及增强对核酸酶的抗性,能诱导RNaseH,因此被称为第一代反义药物。不足之处为有非序列特异性毒性和细胞摄取相对较差。正在研究的第二代反义药物是嵌合型结构,即以PS-ODN为核心,两翼核苷酸序列上核糖的2′位置被其他基团所修饰,如甲氧乙基,已

10〕

显示了良好的前景〔。2.1.2　作用机理　(1)与靶mRNA杂交,形成RNA/DNA双链,形成空间位阻,阻止翻译过程;(2)形成的RNA/DNA双链可以激活RNaseH,将RNA链降解破坏;(3)通过Hoog-steen碱基配对形式,在基因组的靶基因部位,形成三链结构,阻止靶基因复制或转录。

近年来的研究从理论和实际上证明了药物的反义作用机理,判断反义机制的基本要求是该反义序列具备序列特异性和靶向特异性。前者是指与mRNA靶序列互补的序列有活性,不匹配则活性降低。后者是指抑制靶基因mRNA的表达,而对其同工酶及其他基因的mRNA的表达无影响。

9～11〕

如Monia等〔设计的34个针对C-rafmRNA的完全互补20聚体的PS-ODN,其中活性较强的是ISIS5132。用1～7个递次错配的ISIS5132的同系物作为对照,考察了在无细胞条件下与靶序列的融化温度(Tm)值和与靶序列的解离常数(Kd)的关系,随着错配数量的增加,Tm值降低,Kd增大。ISIS5132明显地抑制C-rafmRNA和C-Raf蛋白的表达,也表现出随错配数量增加的抑制作用而减弱。对与结构和功能有关的A-raf激酶和B-raf激酶同工酶国外医学药学分册　1998年10月　第25卷第5期

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ODN阻断某种蛋白的合成是很准确的;(3)反义药物以核酸为靶点,与蛋白质作为受体来比较,更易合理设计新药物。由于作用于遗传信息传递的上游,所需药量较低,副作用可能较少。

1,4〕

2.2　非反义作用〔

一些研究表明,有些反义药物的疗效不能用反义作用来解释。突出的例子就是用反义药物对CML的治疗。此种白血病细胞染色体发生转位,产生费城染色体,导致融合癌基因蛋白BCR/ABL的产生,该蛋白的mRNA被视为反义疗法的理想靶点。有报道表明,反义BCR/ABL可抑制白血病细胞增生,并可能通过非反义作用机理。非反义作用机理还不十分清楚,化学修饰的ODN与细胞内蛋白的结合呈现序列特异性和非特异性作用,其中包括许多与核酸代谢有关的酶,如SPI转录因子、HIV反转录酶和DNA聚合酶等。另外,还可抑制病毒感染。研究ODN的非反义机制会有很大意义。3　药代动力学

磷酸二酯键的ODN易受细胞内外核酸酶降解,给小鼠、兔、猴等动物静脉注射后血浆半

6〕

衰期较短,只有2～5min,研究资料较少〔。PS-ODN的生物物理性质是其药代动力学的决定因素,为聚阴离子寡聚合物、高度水溶性,分

〔6,13,14〕

子量为6800～8500,分子的总化学性质受碱基顺序或组成的影响较小,具有相似的药代动力学和组织分布性质。因此,ODN之间以及种属间的药代动力学性质、组织分布和毒性,则具有较高的可预测性。迄今为止,PS-ODN的药代动力学研究都依赖于放射性同位素标记示踪分析。PS-ODN口服给药后能被吸收,但生物利用度很低。PS-ODN给药(iv,ip或sc)后,与血浆蛋白有很高的结合率,主要是白蛋白和󰀂2-巨球蛋白。药物分布于除大脑以外的所有组织,主要的分布脏器为肝、肾、脾和骨髓。显示二房室模型的特征,分布半衰期(t1/2󰀂)<1h,消除半衰期(t1/2󰀁)一般>30h。3′-核酸外切酶降解破坏是主要的途径之一。大多数以降解代谢物表达水平和对常住基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达水平没有影响,表现出对靶mRNA的专一性。ISIS5132使C-raf蛋白水平减低,用EGF或佛波酯刺激细胞,ISIS5132几乎完全抑制

EGF刺激AMP激酶活性,但佛波酯对AMP激酶刺激无用。错配对照的同系物对此无影响。在体内研究中,ISIS5132明显抑制裸鼠移植瘤的增生,错配对照同系物活性也随错配数量明显降低。瘤体组织中C-rafmRNA和C-Raf蛋白表达,也表现出相似的特点,令人信服地证明了反义作用的机理。

1〕

2.1.3　RNaseH特点〔　RNaseH激活是反义药物与靶序列结合后继发的重要事件,RNaseH是细胞中普遍存在的酶,由DNA-RNA杂交体激活,并切除杂交体中的RNA部分,破坏mRNA,对反义药物的活性有重要影响。在体外能激活RNaseH最短的DNA-RNA杂交体为4个碱基对,在体内能激活RNaseH的杂交体的碱基对的数目还不完全清楚。通过对爪蟾卵母细胞的试验显示,有10个碱基对的RNA-DNA杂交体足以激活RNaseH。2.1.4　体内及体外实验差距　反义PS-ODN为多聚阴离子,不易通过细胞膜。体外实验常需要脂质体的帮助导入细胞。但在动物实验中,反义药物能够顺利地到达靶器官,可被不同的脏器摄取,并发挥疗效。其作用机制还不清楚,但却令人鼓舞。

由于有上述特点,与传统药物相比,反义药物的性质和作用对象均明显不同。Crooke认为,反义药物为药理学的新领域或革命。表现为:新的化学物质受体

寡核糖核酸;新的药物

mRNA;新的受体结合方式

〔12〕

〔4〕

Watson-Crick杂交;新的药物受体结合后反应

如RNaseH介导的靶RNA的降解。反义药物同传统药物相比有以下几个特点:(1)特异性较强,一个15聚体的反义ODN含有30～45氢键;低分子的传统药物(200～600u)与靶点一般只形成1～4个键;(2)反义药物的信息量较大。遗传信息从DNA-RNA-蛋白质,用互补・260・ForeignMedicalSciencesSectiononPharmacy　1998Oct;25(5)

表2　ISIS3521和ISIS5132的毒性与剂量关系

剂量(mg・kg-1)

10080

　　　副作用

免疫刺激/小鼠肝脏毒性猴凝血、补体的效应、肾脏　近曲小管退化

2010

小鼠淋巴增生的最小剂量抑制凝血时间、补体激活、肾脏　近曲小管萎缩及再生的变化

3

轻度抑制凝血时间人的最高剂量2h滴注人的最低药理剂量

由尿中排出体外。人体药代动力学与动物相似。如给艾滋病患者静脉注射(2h)单一剂量35S标

记的GEM910.1mg・kg-1,其血浆消除呈现双相特征,t1/2󰀂和t1/2󰀁分别为0.18和26.7h。注射后6h,仍可在血浆中检测到完整的PS-ODN。在24～96h内大多数35S标记物从尿中排出。对于序列专一性及靶点专一性的分布尚未见到文献报道。

4　反义药物的副作用

1,15〕

反义ODN的毒性有两种潜在的原因〔。一种是以药效学为基础(反义专一性)的毒性,加重药效学作用或与非靶基因杂交而产生的毒性。大于17个核苷酸碱基序列与非靶mRNA杂交的可能性不大。但代谢过程可能使链长度缩短,增加了与非靶基因结合的可能性。理论推算,任何10个核苷酸的序列,在哺乳动物细胞中可能与15～30个mRNA结合。如以丙型肝炎病毒5′非翻译端的序列GCCCCGGGAG为例,在GenBank/EMBI数据检查,有62个基因mRNA含有这样的序列。一旦含有这样序列互补的反义ODN进入细胞,这些非靶基因的mRNA都有RNaseH作用的潜在危险。另一种毒性反应与杂交活性无关,是ODN与其他分子(如蛋白)相互作用的结果,可能有序列特异性,也可能与序列无关。对PS-ODN与蛋白结合的研究揭示,PS-ODN与蛋白结合低亲和力和高容量,比磷酸二酯键ODN大得多。多数PS-ODN的毒性属于非特异性分子的相互作用所致,由于这样一类化合物的生物物理性质相似,毒性谱也是相似的。主要副作用包括:凝血时间延长、补体激活和继发致死性血液动力学变化、肾脏毒性、免疫刺激以及肝脏、血液生化的变化等。以PKC-󰀂、C-raf反义抑制剂ISIS3521和ISIS5132为例,副作用与剂量之间的关系见表2。

PKC-󰀂和C-raf反义抑制剂的抗小鼠抑制瘤的剂量范围为0.006～6mg・kg

-1

2.50.01

假设这些反义抑制剂被靶器官摄取的量在人肿瘤内与移植瘤相当,那么治疗指数是相当高的,高治疗指数是药物选择性强的一种反映。5　结语

反义ODN的临床前研究和临床研究的结果是鼓舞人心的,是基因疗法中容易实现的手段,但也有许多亟待解决以及需要充分评价的问题:(1)作为药物必需合成足够量,并要降低成本;(2)提高ODN在体内及细胞内的稳定性;(3)增强导入靶细胞的能力和效率;(4)研究体内代谢专一性分布状况;(5)ODN的专一性作用的效能和非专一性作用的意义;(6)ODN及其代谢物的安全性、副作用,尤其是长期毒性;(7)反义ODN作为药物在管理中的特殊问题。

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(1997-12-22　收稿)

细胞骨架与信号转导

李云峰综述　张汉霆　罗质璞审校

(军事医学科学院毒物药物研究所　北京　100850)

摘要　细胞骨架是位于细胞核及细胞膜内侧面的一种纤维状蛋白基质,它参与细胞分裂及运动、细胞内物质运输等多种功能,对信号转导的各个环节均有重要调节作用,同时其功能也受到信号转导系统的调节。本文对细胞骨架与信号转导的密切关系及其药理学意义进行了综述。

关键词　细胞骨架;信号转导;G蛋白　　近年研究表明,仅从递质、受体水平研究药物作用机理已经不能满足需要,因为无论药物是否通过受体,都有其复杂的受体后作用过程。它可以通过信号转导及第二信使改变细胞基因表达。信号转导系统已成为公认的药物作用靶之一。