胶原诱导关节炎模型小鼠CCP 抗原特异性T细胞的标记检测及其与特异性淋巴细胞增殖结果的关系

胶原诱导关节炎模型小鼠CCP-抗原特异性T细胞的标记检测及其与特异性淋巴细胞增殖结果的关系*

张敏杰1,2，张晶2，夏海萍2，刘国瑞2，严孝岭2，虞伟2，李晓军2

（1.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013；2.南京军区南京总医院解放军临床检验医学研究所，南京210002）摘要:目的建立基于量子点（Quantumdots,QDs）标记环瓜氨酸肽（CCP）抗原特异

性T细胞（CCP-AST）的流式细胞术（FCM），研究胶原诱导小鼠关节炎模型（collagen-inducedarthritis,CIA）CCP-AST的阳性率及其与CCP抗原特异性淋巴细胞增殖的关系，探索CCP-AST在类风湿关节炎（RA）发生发展中的作用。方法

构建CIA

小鼠模型，用QDs标记链酶亲合素(QD705-SA)结合生物素化的CCP对CCP-AST（CD4﹢CD8﹣CCP-TCR﹢）进行体外标记与FCM检测，同时将CCP与小鼠脾单个核细胞（MSMC）进行共培养，并对其增殖刺激指数（SI）与CCP-AST阳性率及其他参数做相关分析。结果

成功建立QDs标记CCP-AST的FCM术，发现CIA组小鼠CCP-AST阳性率为

（1.017%±1.049%），显著高于PD2B对照肽（0.170%±0.091%）和健康组小鼠CCP-AST阳性率（0.097%±0.099%），差异均有统计学意义（P均<0.05）。CIA组小鼠CCP刺激MSMC出现明显的增殖反应(SI=4.492±1.526)，较健康组小鼠CCP刺激组（SI=0.869±0.046）有统计学意义（P<0.01）。相关分析显示，CIA组小鼠CCP-AST阳性率与CCP刺激MSMC的SI值呈显著正相关关系(r=0.734，P<0.05）。CCP-AST阳性率与关节炎症指数之间亦呈正相关（r值为0.611，P值<0.05）。结论

QDs标记SA结合生物

素化的CCP，可实现对CCP-AST的有效标记和FCM检测，CIA组小鼠CCP-AST阳性率与CCP抗原特异性淋巴细胞增殖结果显著相关，并与CIA小鼠关节肿胀和炎症程度关系密切。

关键词：量子点；环瓜氨酸肽；抗原特异性T细胞；胶原诱导性滑膜炎；增殖Quantumdots-basedlabelingtodetectCCP-antigenspecificTcellsincollagen-inducedarthritisandtheirrelationstoproliferationofspecificlymphocytesresponse

ZHANGMin-jie1,2,ZHANGJin2，XIAHai-ping2，LIUGuo-rui2,YANXiao-ling2,YUWei2，LIXiao-jun2.(1.SchoolofMedicalScienceandLaboratoryMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu,China;2.DepartmentofClinicalExperimentMedicine,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing,Jiangsu,210002,China)Abstract:ObjectiveEstablishquantumdots-basedlabelingflowcytometry(FCM)todetectcycliccitrullinatedpeptide(CCP)-antigenspecificTlymphocytes(CCP-AST)ofthe

*基金项目：国家自然科学基金项目（81071419）；江苏省科技支撑计划—社会发展项目（BE2011786）；江苏省\"六大人才高峰\"项目（内科卫生D203）；江苏省生物材料与器件重点实验室开放研究基金（2010LBMD01）。作者简介：张敏杰，女，1987年4月生，硕士研究生；张晶，女，1987年生。二人对本项研究有同等贡献，并列第一作者。均从事自身免疫病的实验室诊断与发病机制研究。通信作者：虞伟，主任技师，教授，硕士研究生导师，Email:yuwei211@126.comcollagen-inducedarthritis(CIA)mouse.Toinvestigatethestimulationindex（SI）ofCCPantigenspecificlymphocytesproliferationandtheirrelationstothepercentageofCCP-ASTinCIAmouseandresearchtheroleoftheCCP-ASTindiseasesdevelopmentofrheumatoidarthritis(RA).MethodsEstablishthemousemodelofCIA,invitrolabelingofCCP-AST

﹢﹣﹢

（CD4CD8CCP-TCR）withstreptavidincoatedquantumdots(QDs-SA)inconjunctionwithbiotinylatedCCPanddetectCCP-ASTbyFCM.MeanwhileCCPandthemousespleenmononuclearcells（MSMCs）areco-incubated.Toexploretheassociationofthestimulationindex（SI）ofantigenspecificlymphocytesproliferation,andtheabsolutefrequencyoftheCCP-ASTandotherparameters.ResultsTheresultsshowthat:theabsolutefrequencyoftheCCP-AST（1.017%±1.049%）intheCIAgroupweremoresignificantthantheabsolutefrequencyofthecontrolpeptide(0.170%±0.091%),andtheyarealsomoresignificantthanthehealthcontrolgroups(0.097%±0.099%),thedifferencehavestatisticalsignificance(P<0.05).SignificantMSMCproliferationresponsefromCIAgrouptoCCPisobtained(SI=4.492±1.526),significantlyhigherthanthatofthehealthcontrolgroups(SI=0.869±0.046)(P<0.01).Additionally,thepercentageofCCP-ASTwaspositivelycorrelatedwiththeSIofMSMCproliferationfromCIAgrouptoCCP(r=0.734,P<0.05)andthejointinflammationindex(r=0.611,P<0.05）.ConclusionMakeuseofQDs-SAinconjunctionwithbiotin-CCP,wesuccessfullydetecttheCCP-ASTbyFCM.AcorrelationanalysisbetweenthepercentageofCCP-ASTboththeresultsofCCPantigenspecificlymphocytesproliferationresponseandjointinflammationindexrevealsthatthejointswellinglevelispositivelycorrelatedwiththelevelofthepercentageofCCP-AST.

Keywords:QuantumDots(QDs);cycliccitrullinatedpeptide(CCP);antigenspecificTlymphocytes;collagen-inducedarthritis;proliferation

抗原特异性T细胞(antigenspecificTcell，AST)是T细胞通过其表面T细胞受体（TCR）特异性识别抗原提呈细胞（APC）表面的MHC-抗原肽复合物后，分化形成的效应细胞。该细胞群在自身免疫性疾病的发病中起到重要作用。检测AST并鉴别其对特异性抗原的刺激反应，对研究相关临床疾病的发生机制与治疗均有重要意义[1]。

目前，已建立多种检测AST的方法，如51Cr释放法、有限稀释法(limitingdilutionassay,LDA)、胞内细胞因子染色法(intracellularcytokinestaining，ICS)、酶联免疫斑点法(enzyme-linkedimmunospot，ELIspot)以及四聚体（tetramer）技术等[1,2]。上述测定技术，实际应用均有一定的局限性。有鉴于此，亟待探索并建立一种新的AST检测方法。量子点（Quantumdots,QDs）标记技术是一个新的方向。QDs具有较传统荧光染料更优异的光学特性，是一种新型荧光信号示踪物。

类风湿关节炎（rheumatoidarthritis,RA）作为一种典型的由抗原驱动和T细胞介导的系统性自身免疫病（AID），致病性AST活化后，诱导一系列炎症细胞因子的释放与特定自身抗体的产生，是其疾病发生、发展的中心环节[3,4]。因此，研究RA相关AST

及特定靶抗原驱动引起的细胞免疫反应，将有助于临床早期诊断和病情分析。本实验在构建胶原诱导小鼠关节炎模型（collagen-inducedarthritis,CIA）的基础上，用QDs标记链酶亲合素（QD705-SA）结合生物素化的环瓜氨酸肽（biotinylated-cycliccitrullinatedpeptide,Bio-CCP）直接对AST进行体外标记，建立基于QDs标记AST的FCM，研究CIA小鼠脾单个核细胞（MSMC）中CCP特异的细胞CCP-AST阳性率，同时探索其与CCP抗原特异性淋巴细胞增殖的关系，为进一步了解CCP-AST在RA发病机制中的作用提供理论和实验依据。1材料和方法

1.1动物、实验仪器和试剂

24只雄性DBA/1小鼠，清洁级，4～6周龄，购于上海斯

莱克实验动物有限公司；RPMI1640培养液（Gibco公司）；CCP、对照肽PD2B、生物素化CCP（Bio-CCP：氨基酸序列Bio--HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS-）、生物素化对照肽（Bio-PD2B：氨基酸序列Bio--MAIGPYPACGSG-），均由上海强耀公司合成，纯度＞95.0%；QD705-SA，浓度为1μmol/L（美国Invitrogen公司）；Anti-mouseCD3eAPC、Anti-mouseCD4FITC均为eBioscience公司产品,Anti-mouseCD8PE为MultiSciences公司产品；小鼠淋巴细胞分离液（TBD公司）；牛Ⅱ型胶原(bovinecollagenⅡ，bCⅡ,BD公司）；卡介苗（BCG）（上海生物制品研究所馈赠）；FACSCalibur流式细胞仪（BD公司）。1.2方法

1.2.1实验动物及分组24只雄性DBA/1小鼠随机分为健康组和CIA组,各12只。1.2.2CIA小鼠模型的建立

参照本研究组以往报告的方法[5]，简述如下：DBA/1小鼠适

应环境3d，将bCⅡ溶于0.1mol/L的乙酸中，浓度为4mg/mL，在4℃搅拌过夜使之充分溶解。将灭活的BCG置于70℃液体石蜡和羊毛脂(5:3)中充分研磨，浓度为10mg/mL，制成Freund完全佐剂(CFA)。于冰浴下等体积混合bCⅡ与CFA，制成含bCⅡ2mg/mL的乳剂，取150μL于小鼠尾根部注射3点。致炎当日为0d，21d后用bCⅡ与不完全佐剂（不含BCG）乳化，再次以原剂量尾根部皮内多点注射加强免疫；空白组以生理盐水注射，方法同CIA组。1.2.2小鼠关节炎症评分

自首次免疫之日起，每隔1天对小鼠进行关节评分，四肢评

分之和即为关节炎症指数。炎症程度评分标准参照文献[6]：0分，关节无红肿；1分，关节轻度红肿；2分，关节中度红肿；3分，关节重度红肿；4分，关节畸形。1.2.3小鼠脾单个核细胞(MSMC)悬液制备

在小鼠首次免疫后的24天之后，关节炎症

指数达到6分及6分以上时将小鼠拉颈处死，置于75%乙醇中浸泡2min，于超净台中无菌取脾置于4～5mL无菌生理盐水中，洗去血迹，剪去周围的脂肪和筋膜组织，用注射器针芯通过200目尼龙网研磨获得分散的单个脾细胞悬液，用淋巴细胞分离液（2mL）密度梯度离心（2100r/min，25min），吸取白膜层于无菌离心管中，用RPMI1640培养液离心洗涤10min后，弃上清，留沉淀，再用同样方法洗涤一次。用少量含10％小牛血清的RPMI1640培养基分散细胞，混匀，血细胞计数板计数并调节细胞数至3×106/mL。相同的条件下制备健康小鼠MSMC悬液，方法同CIA小鼠。小鼠MSMC悬液制备完成后，一部分用于流式细胞检测，一部分用于培养与增殖实验。1.2.4MSMC培养与增殖实验

CCK-8（CellCountingKit-8）试剂可以用于简便而准确

的细胞增殖分析。其基本原理为：该试剂中的WST-8，可在电子载体的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲噆（formazandye）。其A450nm水平与活细胞的数量成正比。每只小鼠的MSMC悬液做培养与增殖实验时，同时设3组：空白组，仅加细胞悬液；无关抗原对照组，细胞悬液+无关对照肽（PD2B）刺激组；实验组，细胞悬液+CCP刺激组。每组设3个复孔。将MSMC悬液接种于96孔细胞培养板，100μL/孔。CCP、PD2B的终浓度均为20µg/mL。于37℃5%CO2培养箱中培养48h后加入CCK-8试剂（10µL/孔），严格按照试剂盒说明书操作，继续置37℃5%CO2条件下温育4h，待细胞充分着色后，于酶联仪450/630nm双波长下测吸光度（A），并计算特异性增殖刺激指数（SI）。

SI计算方法：以无关抗原对照组MSMC经抗原肽刺激后A均值加3倍标准差（x+3s）为cutoff值。SI=样本A值/cutoff值。

1.2.5CCP-AST的流式细胞术（FCM）检测（1）取5mgBio-CCP粉末用2.5mL无血清培养液溶解，取100μL，向其中加入QD705-SA原液10μL，所得QD705-SA-Bio-CCP溶液避光室温放置30min，备用；同法制备无关抗原对照量子点标记物（QD705-SA-Bio-PD2B）。（2）取QD705-SA原液10μL加至100μL无血清培养液溶解，混匀待用。（3）取4支反应试管，编号为1～4号管，分别加入100μLMSMC（细胞数1×106/mL）；其中1号管为细胞对照，2号管为QD705-SA试剂对照，3号管为CCP-AST测定管，4号管为抗原无关对照（PD2B）-AST测定。（4）加样：2号管中加入1μLQD705-SA；3号管加入1μLQD705-SA-Bio-CCP；4号管加入1μLQD705-SA-Bio-PD2B，避光置室温120min。（5）洗涤：2~4号管中分别加入2mLPBS，

—1500r/min离心5min，弃上清，分别加入100μLPBS重悬混匀。（6）加样：1~4号管中各加入1μLAnti-mouseCD4FITC、2μLAnti-mouseCD3eAPC、2.5μLAnti-mouseCD8PE，避光置室温20min。（7）洗涤：1~4号管中分别加入2mLPBS，1500r/min离心5min，弃上清，加500μLPBS重悬混匀。（8）上FCM检测。应用CellQuest软件获取和分析数据，前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）为线性放大，荧光通道FL1（绿）、FL2（黄）、FL3（红）和FL4（红）为对数放大，结果以CD3+CD4+CD8-CCP-TCR+为CCP-AST阳性，计数CCP-AST阳性率，QDs为红色荧光。1.2.6统计学分析

CIA组和健康组两用SPSS17.0软件进行。各组细胞SI以x±s表示。

—组间SI比较用独立样本t检验。CIA组内CCP刺激组与空白组、无关对照肽（PD2B）刺激组SI比较用配对样本t检验。CCP-AST阳性率与细胞增殖指数、炎症指数之间的关系用Spearman`rho相关分析；CCP-AST阳性率的组间比较用独立样本t检验。以P<0.05为有统计学意义。2结果2.1

CIA小鼠关节炎发病状况

CIA组小鼠在首次免疫24d后足爪关节陆续出现红肿、

功能障碍等典型CIA模型症状，首次免疫30d后，足爪与关节肿胀程度最明显，出现一个炎症高峰，这种状态大概持续15d。2.2

小鼠MSMC经刺激后特异性增殖反应结果

CIA组小鼠CCP刺激MSMC出现明

显的增殖反应，较CIA组空白组、无关抗原对照肽刺激组均有显著统计学意义（t=8.947、t=8.068，P均<0.01）。同样CIA组CCP刺激实验组与健康组CCP刺激实验组结果比较，差异具有统计学意义（t=8.218，P<0.01），见表1。

表1

刺激物CCP、PD2B刺激小鼠MSMC体外增殖结果比较

CIA组例数SI（x±s）—健康组SI（x±s）0.828±0.7770.868±0.0480.869±0.046—空白组无关抗原对照组(PD2B)实验组(CCP)1212120.517±0.1020.393±0.6364.492±1.5262.3量子点标记CCP-AST的FCM检测CIA组和健康组小鼠CCP-AST的量子点标记

FCM检测结果的代表图见图1。CIA组小鼠（n=12）CCP-AST阳性率均值为（1.017%±1.049%）显著高于对照肽PD2B-AST（0.170%±0.091%）及对照组小鼠（n=12）CCP-AST阳性率（0.097%±0.099%），差异具有统计学意义（t=2.785、t=3.024，P<0.05）。

图1量子点标记FCM检测小鼠MSMC中CCP-AST结果图

注：右上相细胞表示为对应AST的阳性率。S1-1：CIA组试剂对照；S1-2：CIA组空白细胞对照；S1-3：CIA组CCP-AST阳性率；S1-4：CIA组无关抗原PD2B-AST对照；D1-3：健康组CCP-AST阳性率；D1-4：健康组PD2B-AST对照；2.5CCP-AST阳性率与CCP抗原特异性淋巴细胞增殖指数、关节炎症指数的关系在

将CIA组小鼠处死制备MSMC悬液之前，记录每只小鼠的关节炎症指数。其均值为6.83。相关性分析结果显示，CIA组小鼠CCP-AST阳性率与CIA组CCP刺激MSMC的SI值呈正相关，直线回归方程为Y=0.80X+3.67，r=0.734，P<0.05；与关节炎症指数也呈正相关，直线回归方程为Y=0.48X+6.35，r=0.611，P<0.05。3讨论

RA的发生、发展是一种复杂的病理生理过程，其发病启动环节涉及到一种重要的三分子复合物（即HLA-DR4-TCR-抗原肽），它是激活相应抗原特异细胞并分泌炎性细胞因子的首要条件[7]。本研究组在前期工作中采用ELIspot技术研究发现，RA患者体内

广泛存在有CCP-AST的活化和异常，CCP-AST阳性率与RA疾病活动程度和关节症状密切相关[8]，这一结果为瓜氨酸化蛋白AST活化在RA中的作用提供了重要证据。

本实验中QDs标记CCP-AST的FCM检测并不涉及到T细胞的活化，为增加游离的抗原肽与TCR-CDR3的结合力，我们采用QDs标记链霉亲和素(QDs-SA)与生物素化CCP(Bio-CCP)相结合，用这种方法制备的QDs表面即包敷多个CCP抗原重复性表位，可有效增加与TCR接触的机会，同时与多个T细胞表面的TCR结合而增加其结合力，因此可实现量子点标记CCP-AST的流式细胞检测。据文献报告，国内同济大学潘敏等[9]采用QDs标记LyP-1小肽（CGNKRTRGC）成功地实现了对SPCA-1肺腺癌细胞表面特异性受体的识别，尽管其与T细胞表面TCR的双识别机制存在不同之处，但通过抗原（短肽）与受体识别并保持足够的结合力是肯定的，因而可用于FCM与荧光成像检测。王丽凤等[10]人将QDs与胸腺五肽(TP5)直接偶联。TP5具有诱导T细胞分化，促进T细胞亚群增殖活化的功效，通过QDs标记检测TP5与TCR结合过程，来研究QDs-TP5在T细胞表面的分布。

研究表明：CIA主要是由福氏佐剂引起先天性免疫反应进而导致系统性炎症反应引发的。福氏佐剂诱导了针对结核分枝杆菌抗原的获得性免疫反应，该反应伴随强烈的CD4+T细胞活动[11]。Vossenaar等[12]在CIA小鼠的滑膜中检测到PAD4和瓜氨酸化蛋白，其中一种为瓜氨酸化的纤维蛋白原。提示，瓜氨酸化蛋白在CIA的发病中起到重要作用。本文在成功建立CIA小鼠模型的基础上，建立基于量子点标记CCP-AST的流式细胞分析技术，研究结果发现CIA组CCP-AST阳性率显著高于健康组小鼠，并与CCP刺激引发的细胞增殖以及关节炎症程度显著相关。由此推测，可能是分子模拟机制使CD4+T细胞受外来抗原（结核分枝杆菌抗原）和自身抗原（瓜氨酸化的纤维蛋白原）刺激活化并分化为CCP-AST从血液迁移并积聚在血管周的滑膜组织中，通过与关节滑膜细胞、巨噬细胞、单核细胞等相互作用引发产生CIA。

4参考文献

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