一个新的水稻C2H2型锌指蛋白cDNA的克隆与序列分析

南京农业大学学报２００２．２５（２）：１１０～１１２　Ｊｏ岍　ｏｆ　域　＾ｇｎａｄｎ　ｚ　Ｕ　一个新的水稻Ｃ２Ｈ２型锌指蛋白ｃＤＮＡ的克隆与序列分析　黄骥　，张红生　，曹雅君’，　王东’，王建飞　，杨金水　江苏南京２１００９５；　复旦大学遗传所，上海２００４３３）　（‘南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，　中圈分类号：￥６０３．４　文献标识码：Ａ　文章编号：１０００－２０３０（２００２）０２　ｏ１ｌｆｆ０３　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｎｏｖｅｌ　Ｃ２Ｈ２　ｚｉｎｃ　ｉｆｎｇｅｒ　ｃＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）　ＨＵＡＮＧ　Ｊｉ　，ＺＩ－ＬＡＮＧ　Ｈｏｎｇ－ｓｈｅｎｇＩ　，ＣＡＯ　Ｙａ－ｊｕｎ　，Ｗ？￣ＮＧ　Ｄｏｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｊｉｍ．ｆｅｉ　，ＹＡＮＧ　Ｊｉｎ－ｓｈｕｉ２　（１．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｍ，Ｎａ　ｉｎｇ　Ａｓｎｃ　Ｕｎｉｖ，　Ｎａｎｉｉｎｇ　２１００９５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖ，ｓｈａｎｇｌ１ａｉ　２００４３３，Ｃｈｉｎａ）　锌指蛋白（ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）是一类具有“手指状”结构域的转录园子，负责调控基因的表达。锌　指蛋白主要通过与核酸的相互作用，显示出不同的功能，如促进转录、抑制转录、单链ＤＮＡ结合、　ＩＫＮＡ结合或ＲＮＡ／ＤＮＡ双向结合＿ｌ－等　Ｃｙｓ２／Ｈｉｓ２型锌指（也称盯ⅢＡ型）是真核生物的转录因子中结　构描述的最为清楚的转录因子，其锌指区为ｃ　一４ＣＸ３ＦＸ５ＬＸ２ＨＸ３　５Ｈ的结构Ｌ２　Ｊ。植物中目前已经克隆了　些Ｃ２Ｈ２型锌指蛋白基因，其中很多锌指区具有ＱＡＬ￣Ｈ的保守区，如与拟南芥花发育相关的ｓｕ－　ＰＥＲＭＡＮ［　与小麦组蛋白ｍ与｝ｌ４基因启动子区域专一性结合的ＷＺＦＩｌ４　Ｊ，拟南芥和棉花中报道的耐　盐锌指蛋白ＳＴＺ［　和ＣＳＴＺ［　，大豆中报道的冷诱导蛋白ＳＣＯＦ．１ｌ７　Ｊ等。ＱＡＬＧＧＨ的保守结构目前只在植　一，物中发现ｌ８１，表明其作为植物特有的一类转录因子可能涉及到植物中特有的事件。　本研究利用一段从盐胁迫水稻幼苗ｅＤＮＡ文库中分离得到的ＥＳＴ序列，经过与ＧｅｎＢａｎｋ中水稻ＥＳＴ　库的同源比较，构建ＥＳＴ重叠群，人工拼接了一个Ｃ２Ｈ２型水稻锌指蛋白的全长ｃＤＮＡ序列，命名为　ＯｓＺＦＰ，并通过ＲＴ．ＰＣＲ的方法获得了该ｅＤＮＡ克隆。经过Ｂｌａｓｔ查新确认后，该ｅＤＮＡ序列在ＧｅｎＢａｎｋ　中登陆，登陆号为：ＡＹ０７７７２５。　ｌ材料和方法　１．１植物材料　太湖粳稻地方品种韭菜青由南京农业大学水稻研究所提供。水稻种子经０．１％ＨｇＣ１２表面消毒处理、　浸种、催芽之后于２５℃温室培养。３叶期用０．８％ＮａＣ１处理３　ｈ后收获幼苗，液氮速冻后置于一８０℃冰　箱中保存备用。　１．２方法　１　２．１总ＲＮＡ的提取和ｅＤＮＡ第一链的合成１．２．２　ＯｓＺＦＰ的克隆与序列测定总ＲＮＡ的抽提采用上海华舜公司的Ｔｆｉｚｏｌ试剂，２　ｖｇ的　总ＲＮＡ用于ｅＤＮＡ第一链的合成（Ｐｒｏｍｅｇａ），并用ＲＮａｓｅ消化ｃＤＮＡ产物。　以从水稻幼苗盐胁迫表达文库中获得的一段约５００　ｂｐ的ＥＳＴ序列　ａｇ一３　，ＺＦ２　￥１２１为信息探针，搜索位于ＧｅｎＢａｎｋ的水稻ＥＳＴ库，通过同源比较，寻找与之部分序列完全一致的　构建ＥＳＴ重叠群（ｅｏｎｔｉｇ），并根据拼接结果设计ＰｃＲ引物ＺＦ１：５　一ｇｃｔｃ舭ａｔ岫ｇａ　收藕日期：２００２－０３—１２　基金项目：高等学较博士点基金资助　作者简介：黄骥Ｏ９７ｓ），硕士生　通讯作者ｃ一、－‘－ｄ嘴￣ｔｈｏｒ：张红生（１９６２）．教授．博导，研究方向：水稻遗传育种。　Ｆ￣ｍａｌｌ：ｈｓ￣ｈａｎｇ＠ｌｉｂⅢａｕ　ｅｄｕ　ｃｎ　维普资讯 http://www.cqvip.com

第２期　黄骥等：一个新的水稻Ｃ２Ｈ２型锌指蛋白ｃＤＮＡ的克隆与序列分析　．Ｉｌｌ　５＇－ｇａａｔｃａａｃｃａｃａａｃｃｇａｃｃａ・３　。ＰＣＲ程序：９４℃５ｍｉｎ预变性；９４℃５０　ｓ，５５℃５Ｏ　ｓ，７２℃１　ｍｉｎ，总计３０　个循环；最后７２℃ｌ０　ｍｉｎ。ＰＣＲ产物以１％琼脂糖电泳检测。将ＰＣＲ产物割胶回收（上海华舜公司）　后，与ｐＧＥＭ－Ｔ载体（Ｐｒｏｇｅｒｔｍ）连接，转化至大肠杆菌感受态细胞ＪＭ１０９，经Ｘ－ｇａｌ／ＩｌｒｌＧ平板培养后．　挑选白色克隆，由上海基康公司完成序列测定。　１．２．３　ＯｓＺＦＰ的序列分析采用ＤＮＡｓｓｉｓｔ软件进行ＯｓＺＦＰ的序列分析与氨基酸序列的推导。用Ｂｌａｓｔ　程序在ＧｅｎＢａｎｋ的核酸数据库和蛋白质数据库中与已知的序列进行同源性比较。　２结　果　２．１　Ｐ的克隆　利用已有的一段约５００　ｂｐ的ＥＳＴ序列搜索水稻ＥＳＴ库，通过序列比较，找到了两个与该ＥＳＴ序列　部分一致的ＥＳＴ，构建了ＥＳＴ重叠群。根据拼接好的序列两端设计ＰＣＲ引物，从盐胁迫水稻幼苗的　ｃＤＮＡｉｇ一链产物中扩增出了１条约８００　ｂｐ的ＰＣＲ产物，命名为ＯｓＺＦＰ。经Ｂｌａｓｔ程序查新后，在Ｇｅ　Ｂａｎｋ中登陆，登陆号为：ＡＹ０７７７２５　２．２　ＯｓＺＦＰ　ｅＤＮＡ序列与序列分析　ＯｓＺＦＰ的核苷酸序列测定结果如图１所示。经ＤＮＡｓｓｉｓｔ软件分析，ＯｓＺＦＰ　ｃＤＮＡ全长８８３　ｂｐ，５　端　非编码区５２　ｂｐ，３　端非编码区３１８　ｂｐ，在３　端发现可能的ｐｏｌｙ（Ａ）加尾信号ＡＡＴＡＴＡ。经ＤＮＡｓｓｉｓｔ软件　分析，编码区５１３　ｂｐ，共编码Ｉ７１个氨基酸，其中含有２个典型的锌指结构（ｃｙｓ２／Ｈ　）（图１下划线　标示）。２个锌指结构都包含ＱＡＩＬ；ＧＨ的保守序列，锌指区符合Ｃ．　Ｃ．．　Ｆ．．　．．【Ｊ＿．Ｈ．．．Ｈ序列，　其中　ｓ．Ｘａａ－Ｃｙｓ和Ｈｉｓ．Ｘａａａ－Ｈｉｓ区之间由１２个主要为酸性及疏水性氨基酸组成的区段隔开，配位结构　（Ｃ２／Ｈ２）加上Ｐｉｌｅ和Ｌｅｕ所形成的疏水核心，确定了锌指的基本结构和形状ｌＢ。　Ｂｃｔｃｇｔｃ　１．ａａｇａｇｃｇａａａｇａａａｇｔｔＢｃｔｔｇｇａａｔｔｃｔ　Ｌ１ｇｇｔｔｔｇｔｌｇｔａ　５２　ｔｇａｃａａｔｃ　ｃｇａｇａｇａａｇａ￣ｇｃｇｇａｇａｇｃａａｇｇａｇａｔｇｇａ卧ｇｃｃ　ｃｇｇｇｔｇｃａｃｇｅｃａｇｃｇｅｇ￣ｔｇｃｔｃｔｃｇｅｔｇｔｃｇｔｃｇｃｃ１ｇｃａ　ｌ　ｄ　２　Ｍ　Ｔ　１　Ｔ　Ｒ　Ｅ　ｇ＾ｇ　Ｓ　Ｋ　Ｅ　Ｍ　Ｅ　Ｓ　Ｌ　Ｒ　ｖ　Ｉ１　ｈ　Ｓ　ｈ　Ｌ　Ｌ　Ｓ　Ｌ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　ｈ　ｇｃｇｔＣｇｇＣｇｔｃｇｃ　ｇｃｃｇａｃｇｔｏｇｔｃｇｔｃｇ　ｇａｃｇａｃｇｇａｇｇｇｇｇｔｇｔ　ｇａＳｔｇｃａａｇａｃｇｔｇｃａｇｃａａｇｃｇｇｔ【ｃｃｃｇｔｃｇｔ　Ｌｃｃａｇ　２３２　ｈ　Ｓ＾Ｓ　Ｏ　Ｐ　Ｔ　Ｓ　Ｓ　Ｓ　Ｓ　Ｔ　Ｔ　Ｅ　Ｇ　Ｖ　Ｆ　Ｅ　Ｃ　Ｋ　Ｔ　Ｃ　Ｓ　ｘ　Ｒ　Ｐ　Ｐ　Ｓ　Ｆ　Ｏ　ｇａｃａｇｇｇｃａｃｇ￣ｇｔｃｃ５ｃｇａｇｔｇｃｇｅｃｇｔｇ［ｇｃｇｇｇｇｌｃｇａｇ“ｃ【ｃｃａ【ｇｇｇｇｃ￣ｔｇｇｃｇｃｔｃｇｇｃｇｇｃｃａｃ￣ｔｇｃｇｃｃｇｇｃａｃ＆ｇｇｇｇｅ　４Ｉ　２　Ｄ　Ｒ＾Ｒ　Ｖ　Ｈ　Ｅ　Ｃ＾Ｖ　Ｃ　Ｃ　Ｖ　Ｅ　Ｆ　Ｓ　Ｍ　Ｃ　Ｏ　Ｉｔ　Ｌ　Ｃ　ＧⅥＭ　Ｒ　Ｉｔ　Ｈ　Ｒ　Ｃ　ｇａｇａｃｇｇｇｃａｃｇａｃｇａｃｃｇｔｃｇｔｇｃｔｃｇｃｇｇａｃｇｃｃｇａｃｇａｃ１ｃｇｇｇｃｇｇｃｇｅｅｏ．ｃｃｇｔｇｃｃｇｃａｇｃｃｇｃｃｇｇａｇ￣ｃｃａ【ｇｅ，ｅｇｇａｅｃｔｇ　５０２　Ｅ　Ｔ　６　Ｔ　Ｔ　Ｔ　ｖ　ｖ　Ｌ＾Ｄ　ｔｔ　Ｄ　Ｄ　Ｓ　Ｃ　Ｃ＾Ｔ　ｖ　Ｐ　Ｏ　Ｐ　Ｐ　ｇ　ｐ　Ｍ　Ｐ　Ｏ　Ｌ　ａｃｌ￣ｔｃｃｃｇＣｃｇｃＩｇｇａｇｇａｃｇｃｃｇｇｃｇａｃｇｇｃ　ｃｇ　ｇｃｃｔｇａｇｌ¨ｃＩＩａ　ｃｃ｜ｌｃ“ｇ１　ｌⅡ５ｇ１ｌｇｃ　ｌｃ窖＾１ａｇａｌａｔａｃａｔｇｌｇ　５９　２　Ｎ　Ｙ　Ｐ　Ｐ　Ｌ　Ｅ　Ｄ　ｈ　Ｃ　Ｄ　Ｃ　Ｓ　ｇ　Ｐ　Ｅ　Ｌ　Ｌ　Ｈ　Ｌ　Ｌ　ｖ・　ａａｔｔｇａｉｔ【ｔｇｇｃｇｔｃｌ　ｇｔＨｃａｔ　ｕｇａｌａｔｇｇｔｇｇａｔｇｇａｔｔｃｔｔｔａｅｃａａａｔｔｔｇａｔｃｇａａａａａａａｇａａｃｔａ　ａｌｔ【ｌｇｇａｇｅｇｔｇａｔｇａｔ　６９２　㈨ｔ　ｇｃａｔｇｔ　ａｇｔｔｇｔ　ＨａｃＢＢＢｌｇａｔｔｇｔ“ｌａｃｌｇｔａａｇａｔ　＝ｇａａｔｔｃｔ　ｔ１ｃＢｔ　Ｌ１ｇｔｔｃｔｃｔｌｃｔｇ¨ｃＢａ　ａｔｔａｃａａａｔａｇｇｔｔ　７７２　ｅ　ｔｔａａｔ　ａｓｔｔｇｇｔｃｇｇｔｔｇｔｇｇｔｔｇａｔｔｃ　Ｌｔｔｇｔ　ａａａａｔａｃｃａａｔｔｔ　ａ，ｃｔａｇｔａｔ垣受圈ｃｔｇａｃａｇｃｔｔａ¨Ｅ¨ｔｃａＢａＢ　５　ａ　ｇ６２　日　ａａ　ａ　ａａ　Ｈａａ８　ａａａ　Ｈ　８８　３　图１　Ｏ￣ＺＦＰ的ｄ）ＮＡ序列及推导的氨基酸序列　ｎｇ．１　ＴｌＩｅ　ｎｕｃｌｅｏＣＲｌｅ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｍｎｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｃｑｕ￣ｆｏｒＯｓＺＦＰ　ｏｆＯｒｙｙ．ａ　如　（下划线标示锌指区，加框表示可能的Ｐｄｙ（Ａ）加尾信号）　（Ｚｉｌ／ｅ　ｆｉｎｇｅｒ　ｍｏｔｉｆ　ｉｓ　ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ，ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｐｏｌｙｄｅｎｙｌａｆｉ￣ｎ　ｉｓ　ｂｏｘｅｄ）　２．３　ＯｓＺＦＰ推导的氨基酸序列的同源性分析　通过Ｂｌａｓｔ程序的序列比较，ＯｓＺＦＰ推导的氨基酸序列与矮牵牛锌指蛋白ＺＰＴ－１３和ＺＰＴ－１２同源区的　氨基酸相似性分别为：６０％和５７％（图２）　除此以外，与其它植物锌指蛋白氨基酸的相似性都很低　（资料未列）。　维普资讯 http://www.cqvip.com

南京农业大学学报　第２５卷　ｚＤｔ－Ｉ　３　ｚｐｔ—Ｉ　２　７５　７６　ｕｓｚｆｐ　７９　ｚｐｔ一１　３　ｉｚｐｔ－］２　｛　Ｉ５　３　ｊ　５　２　０ｓｚｒＰ　Ｉ５５　ｚｐｔ－［３　ｚ０　Ｉ　２　ｏ￥ｚｆＰ　ＩＴ＇ｌｌ　围２　ＯｓＺＥＰ推导的氨基酸序列与其它锌指蛋白氨基酸的同源性比较　血　恤　啦．２　Ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｄｄ　ｓｅｑｕｍｃｅ　ｏｔＯｓＺＥＰ　ｃ．ＤＮＡ柚　ｅｄｗｉ血ｔｈｅ　ｓｅｑｕｍｃｅ　ｏｔ　ｏｔｈｅｒ　（加框表示高度保守的ＱＡ［ＧＧＨ）　（ＨｉｇｈＸｙ　ｃｏｒｒｓｅｒｖｅｄ　ｍｏｔｉｆ　ＱＡｌ舢ｉｓ　ｂｏｘｅｄ）　３讨论　随着ＥＳＴ数据的日益丰富，利用ＥＳＴ拼接获得基因全长序列的电子克隆方法应用日益广泛。与常　规的筛选ｃＤＮＡ文库或ＲＡＣＥ．ＰＣＲ技术获得基因全长序列的方法相比，电子克隆操作简单、速度快。但　是，由于电子克隆对核酸序列资料的巨大依赖性，使得植物中电子克隆的方法目前只能应用于拟南芥和　水稻等，而且并不是任意的ＥＳＴ序列都能找到与之完全一致的其他ＥＳＴ资料。　含有ＱＡｍＧＨ结构的Ｃ２Ｈ２型锌指蛋白是植物中特有的一类锌指蛋白。本研究从盐胁迫水稻幼苗中　克隆到了一个新的水稻锌指蛋白基因ＯｓＺＦＰ，表明该基因在盐胁迫条件下是表达的，很可能涉及到盐　胁迫下的基因表达调控。这还需要进一步的差异表达研究与转基因研究来鉴定它的功能。　参考文献：　：１］　张民，余龙，胡培蓉，等１７个新啦ｍ型锌指基因片段的分离与克隆［¨　生物化学与生物物理学报．１嘲，３０（５）：４６５－４７０　ｏｆ　ｓａｂｓｅ￣ｏｆ　ｔｈｅ＾　ｆ如　厶ｃｙｓ２／｝ｈ昌２　ｔｙｐｅ　ｆｉＴ。８盯ｐｒ￣ｅｌｎ　∞ｅ　ｒ帅ｍｙ　ｄ　ｗ８时ｓｌｒ哪　：２］　Ｉｆｔｄｄｄ　Ｓ，Ｔａｋａｓｈｉ　Ａ，Ｔｅｔｓｕｏ　Ｍ，“ａ１．Ｅ印　［¨．Ｇ　，２ＯＯＯ，２４８：２３－３２　３］　Ｓａｋａｉ　Ｈ，Ｍｅｄｒａｎｏ　Ｌ　Ｊ，Ｍｅｙｅｉ＇ｃａ，ｄｔｚ　Ｅ　Ｍ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ＳＵＰＥＲｂＬ￣Ｎ　ｉｎ　ｔｍｌｎｔａｉｎ＾ｍ＆出　“ｆｌｏｒａｌ　ｗ｜　ｄ　ｂ０ｕｎｄａｒｉ　［Ｊ］Ｎｍｕ　，１９９５，３７８：１９９—　２０３．　［４］【　ｐ呷唧Ｖ．Ｍａｒｔｈａ　Ｓ，ａ１　器Ｓ，ｅｆ　．Ｔｗｏ　ｃｌ蕾瞵０ｆ　町ｌｔ　ｅＤＮＡ　ｃｌｏｎｅｓ　ｄｉｆｅ￣ｎｔｌａｌｌｙ　ｃａｍｐｌｅｍｅｍ　ｙｅａｓｔ　ｃＢＩａｎ即　ｎ　ｒ叫　口∞ｏｆ￣ｌｄ－ｔｙｐｅ　ｙ％Ｉ．ａｎｄ…ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒ一　Ｊ］Ｊ　ｄ　０　，１９９６，２７１：１２８５９－１２８６６　［５］　ＳａｋｍｏｔｏＡ，Ｍｉｎｅｒ￣Ｍ，ＨｕｈｃＨ，　ａｌ　Ｔｉｌｅ　ｐｕｔａｆｉ＊￣ｚｉｎｃ—ｉｆｎ￣ｅｒ　ｐｌｏ￣ｅｎＷＺＦ１ｉ　【眦恺　Ｊ　Ｂｉｏｄａｃａｌ、１９９３，２１７：１０　１　．　８　ｃｉｓ－￣ｆｉｎ￥ｅｌｅｍｅｎｔｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｈｉｓｔ￣Ｉ￣ｅｎｅｓ　¨．Ｆｕｒ　［６　［７　王东，杨金水棉花类耐盐锌指蛋白基因的克隆与结构分析…Ｋｉｍ　Ｊ　ｃ，Ｌｅｅ　Ｓ　Ｈ，０瑚噶Ｙ　Ｈ，ｄ　ａｌ　Ａ　１　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］　ｐｌａｎｔ　Ｊ，２００１，２５：２４７－２５９．　复旦学报（自然科学版），２００２，４１（Ｉ）：４２—４６　ｃｏｌｄ・ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｚｉｎｃ　Ｆｒｎｏ￣ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｗｍ　ｓ０ｙｂｅ阻，ＳＣＯＦ－１．ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｃｏｌｄ　ｔｏ［ｅ．ｒａｎ￣ｉｎ呐ｍ　［８］Ｂ　一Ｌ　Ｇ印ｅ　ＶＩ［Ｍ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｏｄｏｒｄ　ｕ　ｖＢ　Ｐ　，１９９７　８５０－８５５．　责任编辑：张耀拣