贻贝粘蛋白Mgfp-5基因重组表达载体的构建方法及转化菊苣[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105936916 A(43)申请公布日 2016.09.14

(21)申请号 201511006800.5(22)申请日 2015.12.30

(71)申请人 西北大学

地址 710069 陕西省西安市太白北路229号(72)发明人 吕亚维　王睿劼　吕玉伟　杨泽熵　

张雨靖　王英娟　(74)专利代理机构 西安西达专利代理有限责任

公司 61202

代理人 谢钢(51)Int.Cl.

C12N 15/84(2006.01)C12N 15/66(2006.01)C12N 15/12(2006.01)A01H 5/00(2006.01)

(54)发明名称

贻贝粘蛋白Mgfp-5基因重组表达载体的构建方法及转化菊苣(57)摘要

本发明公开了一种含有贻贝粘蛋白Mgfp-5基因的植物表达载体，其将贻贝粘蛋白Mgfp-5基因与植物表达载体pRI101-AN重组得到表达质粒pRI101-Mgfp，所构建的植物表达载体pRI101-Mgfp含有植物表达所需要的启动子和终止子，适合携带外源基因片段进入植物基因组。本发明以植物作为受体，不仅有着对翻译后的重组蛋白更高的糖基化和磷酸化等比较高级的真核蛋白合成途径，可以增加黏蛋白的粘附性能，而且在规模化生产、安全性和生产成本方面也有较大优势。CN 105936916 A权利要求书1页 说明书5页 附图3页

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权　利　要　求　书

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1.一种含有贻贝粘蛋白Mgfp-5基因的植物表达载体，其特征在于：将贻贝粘蛋白Mgfp-5基因与植物表达载体pRI101-AN重组得到表达质粒pRI101-Mgfp，所构建的植物表达载体pRI101-Mgfp含有植物表达所需要的启动子和终止子，适合携带外源基因片段进入植物基因组。

2.权利要求1中所述贻贝粘蛋白Mgfp-5基因重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：（1）前期Mgfp-5基因保存在pUC57克隆载体上，根据植物表达载体pRI101-AN的多克隆位点设计引物，在Mgfp-5基因5’-端添加NdeI酶切位点，3’-端添加KpnI酶切位点，其引物序列为：

正向引物：5’-GGAATTCCATATGAGTTCTGAAGAA-3’；反向引物：5’-GGGGTACCCTAATGGTGATGGTG-3’；

并将得到（2）将PCR扩增后的反应液和植物表达载体pRI101-AN用NdeI和KpnI双酶切，

的pRI101-AN载体片段去磷酸化，纯化回收得到的Mgfp-5基因片段和pRI101-AN载体片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆扩大培养，提取质粒双酶切验证，将阳性重组质粒命名为pRI101-Mgfp。

3.权利要求1所述的重组表达质粒pRI101-Mgfp的遗传转化方法，包括以下步骤：（1）制备农杆菌LBA4404感受态，然后将重组质粒pRI101-Mgfp通过冻融法转化到根癌农杆菌，得到含有Mgfp-5基因的根癌农杆菌LBA4404；（2）将获得的阳性农杆菌LBA4404侵染菊苣获得转Mgfp-5基因菊苣；（3）提取菊苣基因组DNA和RNA通过PCR及RT-PCR鉴定阳性转基因植株。

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说　明　书

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贻贝粘蛋白Mgfp-5基因重组表达载体的构建方法及转化菊苣

技术领域

[0001]

本发明涉及一种适合在菊苣、烟草、拟南芥等双子叶植物中表达含有贻贝粘蛋白Mgfp-5基因的表达载体pRI101-Mgfp，属于基因工程技术领域。背景技术

[0002]贻贝(Mytilus galloprovincialis )属于海洋软体动物门瓣鳃纲，大多数隶属贻贝科，贻贝足腺能分泌足丝蛋白(mussel foot protein，Mfp)或称贻贝粘蛋白(mussel 

MAP)，使其能够黏附并固定在外界各种固体表面(基体)，尤其是在水环adhesive protein，

境下能够展现出强黏附性能。

[0003]研究发现贻贝足丝蛋白有着特殊的氨基酸组成和结构，多肽链中存在大量的重复单元，几乎每种多肽链都包含酪氨酸经翻译后羟基化修饰的3,4-二羟基苯丙氨酸残基(多巴，DOPA)，残基的苯酚基团有强的金属螯合能力和与蛋白质等极性聚合物形成强氢键的能力，可在材料表面产生极强的粘附力。贻贝足丝蛋白是由多种蛋白组成的复合体，目前已鉴定主要有Mfp-1~Mfp-6的6种类型粘附蛋白以及3种胶原蛋白质前体(precollagen, preCoI, preCoI-D, preCoI-P, preCoI-NG)。其中，足丝蛋白Mfp-5主要分布在贻贝足丝盘与外界基质的接触面上，被认为是贻贝足丝蛋白发挥黏附功能的主要蛋白分子，并且DOPA的含量最高(25-30%)。[0004]MAP具有无毒、无害、无免疫原性以及良好生物相容性；具有的高强度、高韧性、防水及耐腐蚀性等特征。可作为各个研究领域的优质的粘合剂。目前贻贝粘合蛋白主要从天然贻贝中提取(美国BD公司)获得，但是贻贝天然分泌的蛋白量极少(10 000只贻贝分泌量约1g蛋白)，且极易在短时间内固化，造成其提取成本高、价格昂贵，迫使人们尝试利用基因工程途径解决贻贝粘合蛋白材料来源短缺的问题，促进其临床应用实现。目前已有报道在原核生物中转化和表达，但粘附性能不及天然的提取的蛋白，然而利用植物基因工程表达粘合蛋白目前依然是具有挑战性的研究。

发明内容

[0005]本发明利用植物基因工程构建含有地中海贻贝蛋白(Mytilus galloprovincialis foot protein 5; Mgfp-5)基因的表达载体pRI101-Mgfp，通过农杆菌介导法导入到菊苣等植物当中，获得含有Mgfp-5的转基因植株，为植物中表达Mgfp-5蛋白、用基因工程技术获得优质粘合剂提供了重要的实验材料，也为后期植物表达的重组粘蛋白的黏附等性能研究奠定基础。[0006]本发明实现过程如下：

一种含有贻贝粘蛋白Mgfp-5基因的植物表达载体，将贻贝粘蛋白Mgfp-5基因与植物表达载体pRI101-AN重组得到表达质粒pRI101-Mgfp，所构建的植物表达载体pRI101-Mgfp含有植物表达所需要的启动子和终止子，适合携带外源基因片段进入植物基因组。

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上述贻贝粘蛋白Mgfp-5基因重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：（1）前期Mgfp-5基因保存在pUC57克隆载体上，根据植物表达载体pRI101-AN的多克隆位点设计引物，在Mgfp-5基因5’-端添加NdeI酶切位点，3’-端添加KpnI酶切位点，其引物序列为：

正向引物：5’-GGAATTCCATATGAGTTCTGAAGAA-3’；反向引物：5’-GGGGTACCCTAATGGTGATGGTG-3’；（2）将PCR扩增后的反应液和植物表达载体pRI101-AN用NdeI和KpnI双酶切，并将得到的pRI101-AN载体片段去磷酸化，纯化回收得到的Mgfp-5基因片段和pRI101-AN载体片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆扩大培养，提取质粒双酶切验证，将阳性重组质粒命名为pRI101-Mgfp。

[0008]上述的重组表达质粒pRI101-Mgfp的遗传转化方法，包括以下步骤：

（1）制备农杆菌LBA4404感受态，然后将重组质粒pRI101-Mgfp通过冻融法转化到根癌农杆菌，得到含有Mgfp-5基因的根癌农杆菌LBA4404；

（2）将获得的阳性农杆菌LBA4404侵染菊苣获得转Mgfp-5基因菊苣；（3）提取菊苣基因组DNA和RNA通过PCR及RT-PCR鉴定阳性转基因植株。[0009]本发明以植物作为受体，不仅有着对翻译后的重组蛋白更高的糖基化和磷酸化等比较高级的真核蛋白合成途径，可以增加黏蛋白的粘附性能，而且在规模化生产、安全性和生产成本方面也有较大优势。

附图说明

[0010]图1 pRI101-Mgfp 载体的构建；

图2为重组质粒双酶切验证；图3为农杆菌阳性菌落PCR鉴定；图4为阳性菌落测序比对；

图5为菊苣的遗传转化及转化植株获得；图6为部分阳性植株PCR检测；

图7为部分转基因植株的RT-PCR检测。

具体实施方式

[0011]本发明含有贻贝粘蛋白Mgfp-5基因的重组植物表达载体并举例转化受体植株，包括如下步骤：

1．贻贝粘蛋白Mgfp-5基因重组表达载体的构建方法（1）前期Mgfp-5基因保存在pUC57克隆载体上，根据植物表达载体pRI101-AN的多克隆位点设计引物，在Mgfp-5基因5’-端添加NdeI酶切位点，3’-端添加KpnI酶切位点，其引物序列正向引物：5’-GGAATTCCATATGAGTTCTGAAGAA-3’；反向引物：5’-GGGGTACCCT

AATGGTGATGGTG-3’；PCR反应体系Taq酶0.5 μl，PCR Buffer 2 μl，正向引物(10 μmol/l)和反向引物 (10 μmol/l)各1.0 μl，模板1.0 μl，ddH2O 14.5 μl，总体积20 μl。扩增程序：95℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40s，循环34次；72℃延伸10 min。取3μl PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并对PCR纯化产物进行Nde I 和EcoR 

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I双酶切，试剂盒纯化回收PCR酶切产物，备用；

（2）用KpnI和NdeI双酶切植物表达载体pRI101-AN，40μl体积的酶切反应体系为：

酶切完成后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收所需载体pRI101-AN37℃水浴过夜，片段，由于Nde I酶切出的突出末端比一般的2个碱基突出末端的连接效率低，所以必须使用平末端的连接条件，即将pRI101-AN片段进行去磷酸化反应，去磷酸化完成后进行DNA的纯化回收。50μl体积的去磷酸化反应体系为：

（3）回收的Mgfp-5基因片段和pRI101-AN载体片段，二者用T4 DNA连接酶连接，16℃连接过夜。体系为：

（4）将上述连接反应体系转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆扩大培养，提取质粒双酶切验证(图2)，结果显示在260bp处出现特异性条带，对照没有出现。将阳性重组质粒命名为pRI101-Mgfp；

2．pRI101-Mgfp转化农杆菌（1）感受态细胞的制备：在YEB固体培养基上划线培养农杆菌LBA4404单菌落；（a）农杆菌LBA4404菌液涂在含有利福平(Rif)25mg/l、链霉素(Str)100mg/l的YEB固体培养基中，28℃倒置培养2d；

（b）挑取单菌落接种于10ml含YEB液体培养基中Rif25mg/l、Str100mg/l，28℃，200 rpm

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振荡培养；

（c）按1:100接种于50ml YEB培养基中扩大培养，待OD600=0.4~0.5时，菌液倒入预冷的50ml的离心管中，冰浴10min，4℃，4 000 rpm，10min离心，弃上清，收集菌液，在超净工作台上倒置1min；

（d）用10ml预冷的70 mmol/l CaCl2重新悬浮沉淀，冰浴30 min；（e）4℃，4 000 rpm离心10min，弃上清，加入2ml预冷的70 mmol/l CaCl2(15%的甘油)悬浮细胞，分装，-80℃保存。[0012]（2）冻融法转化农杆菌

取0.1μg重组质粒pRI101-Mgfp加入到100μl的LBA4404感受态细胞中，冰置60-90 min；液氮速冻5min，迅速取出，28℃水浴热激5min；加入500μl YEB液体培养基，28℃，100 rpm培养2-3h；将菌液均匀涂布在含有Rif (25mg/l)、Str (100mg/l）和Kan( 50mg/l)的YEB固体培养基上进行筛选；挑取单克隆进行菌液PCR，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在260bp处出现特异性的目标条带(图3)，与预期条带大小相符。挑取阳性克隆送进行公司测序，目的基因序列与Genebank中的序列(GenBank:AY521220.1)100%相同，且插入位点正确(图4)，说明含Mgfp-5基因的重组质粒pRI101-Mgfp已成功转入到农杆菌LBA4404中。[0013]3. 菊苣的遗传转化

将测序正确的阳性单菌落培养在相应抗生素的YEB液体培养基中培养至OD600=0.5~0.6，备用。

[0014]叶盘转化法：a. 用培养好的含有目的基因的LBA4404侵染菊苣叶片10min，期间不停摇晃；b. 取出叶片，用无菌的滤纸吸干，然后转移到共培养基MS+6-BA2mg/l+NAA0.2mg/l中暗培养3d (图5A)；c.将叶片转到筛选培养基MS+6-BA2mg/l+NAA0.2mg/l+Kan50mg/l+Cef500

mg/l，置于25±2℃，光/暗16h/8h培养，进行抗性愈伤组织及不定芽的筛选(图5B)；d.将形成的2~3cm抗性芽(图5C)切下转到生根培养基MS+NAA0.2mg/l+Kan50mg/l+Cef500mg/l上(图5D)，置于25±2℃，光/暗16h/8h培养，及时淘汰非转化芽体；待根长1~3cm时，炼苗移栽(图5E-5F)。

[0015]4. 转基因菊苣的阳性鉴定

为了验证Mgfp-5基因是否转到菊苣基因组中及转录表达，取菊苣叶片提取全基因组DNA和RNA并进行PCR及进行RT-PCR鉴定；

（1）采用CTAB法从转基因株系中提取叶片的基因组DNA，以野生(未转目的基因的植株做空白对照)进行PCR检测，具体步骤如下：

(a)取0.2g叶片，液氮充分研磨，加650μl 2×CTAB 65℃水浴1h期间每隔10 min摇一次；然后加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，室温放置30 min，12 000 rpm离心10min，取上清(用减过的枪头，避免破坏基因组DNA)，重复一次；上清加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，沉淀2h 以上，12 000 rpm离心10 min，用70%的无水乙醇洗涤沉淀两次，离心，彻底吸干乙醇，待干燥后，加入200μl的ddH2O，4℃过夜溶解，置-20℃保存备用；

(b)为排除目的片段与引物二聚体重叠，根据载体及目的基因的DNA片段，设计引物扩增约500bp的目标条带。引物序列分别为：

正向引物：5’-CCAGGCAATACTTACCACTA-3’

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反向引物：5’-ACTTCTTGTAACCCTTTCTATG-3’反应程序：95℃预变性 5min，94℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸40s，34个循环，72℃延伸10min。结果用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在部分转化的植物中扩增出特异性条带，而对照没有(如图6)，说明Mgfp-5基因已经整合到植物菊苣当中。[0016]（2）菊苣总RNA的提取以及进行RT-PCR检测，具体步骤如下：

(a)采用TRIzol试剂法总RNA的提取，具体步骤如下：取0.2g叶片，液氮充分研磨，迅速转入预冷的1.5ml的EP管中，加入1ml TRIzol试剂混匀；15~30℃放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；4℃，10 000 rpm 离心10min，取上清；加0.2ml氯仿盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min；4℃，10 000 rpm 离心10 min，样品分三层(底层有机相/中间相/上层无色水相)，RNA存在于水相最上层，转移水相至新EP管，加入0.5ml异丙醇沉淀，4℃，10 000 rpm离心10 min，取上清；加1ml 75%乙醇(使用DEPC处理过的水配制)洗涤沉淀，4℃，7 500 rpm离心10 min，弃上清；室温放置晾干，沉淀为RNA，加25~200μl DEPC水，55~60℃放置10min溶解，置-80℃保存备用；

(b)基因组DNA的去除:往微量离心管中配制下列反应液，体系为50μl：

37℃反应20-30min，加入50μlDEPC水，加入100μl的本分/氯仿/异戊醇(25:24:1) 4℃，12 000 rpm离心10min，取上清，再加入100μl的氯仿/异戊醇(24:1)充分混匀，4℃，12 000 rpm离心15min，上清加入10μl的3mol/l的醋酸钠(Ph 5.2)，再加入250μl的预冷的无水乙醇，-28℃放置30-60min，4℃，12 000 rpm离心10min回收沉淀，室温干燥，往沉淀加入25~200μlDEPC水溶解沉淀，进行电泳检测；

(c)RNA反转录cDNA使用TaKaRa的PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将RNA反转录为cDNA作为RT-PCR的模板；引物序列为：

正向引物：5’-GGAATTCCATATGAGTTCTGAAGAA-3’；反向引物：5’-GGGGTACCCTAATGGTGATGGTG-3’反应程序：95℃预变性5min，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸40s，34个循环，72℃延伸10min。结果用1%的琼脂糖凝胶电泳检测(野生的为空白对照)，RT-PCR结果显示(图7)，260bp处出现特异性条带，对照没有。结果表明，Mgfp-5基因能够成功的在菊苣中转录表达。

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