新：干旱迫处理后各生理生化指标的测定方法

① 盐胁迫处理后叶片细胞膜透性（即电导率）的测定（已完成）

植物细胞膜起调控细胞内外物质交换的作用，它的选择透性是最重要的功能之一。当植物组织受到逆境伤害时，细胞膜受到不同程度的破坏，膜的透性增加，选择透性丧失。细胞内的各种水溶性物质包括电解质将有不同程度的外渗，其中包括盐类和有机酸等。这些物质进入环境介质中，如果环境介质是无机离子水，水的电导率值将因电解质的外渗而加大。膜受到伤害愈重，水溶性物质外渗愈多，电导度的增加也愈大。故可用电导仪测定外渗液的电导度增加值而得知伤害程度。 试验器械及试剂：

电导率仪、超纯水仪、真空仪、50mL小烧杯、电子天平、水浴锅 试验操作步骤：

仪器的清洗：

用自来水清洗50mL烧杯，再用蒸馏水洗3遍，超纯水洗3遍，随后用超纯水平衡24小时以上，在烘箱内烘干备用。 电导率测定：

将供试材料叶片用自来水洗去表面灰尘，再用双蒸水和超纯水冲洗3次，用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分，然后保存在湿纱布中，以防止叶片失水。每样品设3次重复，每个重复取质量近似相等的避开大叶脉的叶片，放入50mL烧杯中，用小玻璃棒轻轻压住材料，准确加入20mL超纯水，浸没样品，在室温下真空处理20min，取出后静止放置10min，用DDS-18A数字型电导仪测定浸出液电导率为“K1”。再放在100℃沸水浴中加热10分钟，以完全破坏质膜，冷却后测定各溶液的电导率为“K2”。 结果计算方法：

外渗液相对电导率=K1/K2×100%

② 光合速率的测定（已完成）

试验器械及试剂

仪器：光合测定仪

实验仪器为PP-system公司生产的CIRAS-2便携式全自动光合测定系统，这是国内目前最先进的测定光合作用的仪器，所得指标多、全、相关度大。 试验方法

每株植物选择近同等部位1～2片向阳功能叶片，水平角度进行不离体测定。

③ 叶绿素含量测定（未做）

一、 原理

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可

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求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。

（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。 （三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。 三、实验步骤

1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml96％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm及470nm下测定吸光度。

四、实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665－6.88A649；Cb=24.96A649－7.32A665(类胡萝卜素参见另一本书)。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：

叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。

④ 可溶性总糖测定（蒽酮比色法）(未做)

（1） 原理：糖+硫酸—糠醛，其与蒽酮形成绿色络合物，620nm下显色。本实验采用浓硫酸，

倒入水中产生大量热，促进反应发生。

（2） 标准曲线绘制：取略大于0.01g的葡萄糖，105度烘干至恒重，取0.01g定容至100ml，

配成100ug/ml的溶液。取200mg蒽酮，溶于100ml 浓硫酸，冷却，保存于棕色瓶。（注意：不需定容，量取100ml硫酸倒入烧杯即可，定容混匀时产气热溅出。注意硫酸中是否存在杂质。蒽酮非常敏感，不能用勺等挖取，只能直接倒，否则就会污染。溶液配后呈亮黄色，放置顷刻不变色。） 标糖溶液ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水ml 2.5 2.3 2.1 1.9 1.7 1.5 蒽酮溶液ml 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 糖含量ug 0 20 40 60 80 100 总体积9ml，快摇2-3s，室温冷却10-15min，显色，620nm.

实验结果：实际上并不理想，因abs均偏低，可试将标糖浓度适当升高。 葡萄糖含量ug 20 40 60 80 100 abs 0.09 0.169 0.259 0.332 0.427

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20070830可溶性糖标准曲线0.50.4y = 0.0042x + 0.0043R2 = 0.9987系列1线性 (系列1)abs0.30.20.10050100葡萄糖浓度150

⑤ 植物酶液提取(用于测SOD,POD,CAT):(未做)

1) PVPP(固体,PVP单体与金属元素结合) 酚类吸附剂，酚的羟基与蛋白质的羰基形成氢键，

醌导致蛋白质聚合。或polyclarAT（Polyclar-AT is insoluble PVP, also called as PVPP (PolyVinyl PolyPyrrolidine). It binds phenols etc more efficiently than PVP and is easily removable by filtration or a low speed spin）去除酚的毒害防止醌颜色干扰。PVP的肽键中的氧与酚羟基上的质子牢固结合，防止酚与酶中肽键结合，保护了酶。

2) 母液制备：0.1mol/L二硫苏糖醇DTT: 100mg至微量离心管，+650ul 水 0.5mo/L EDTA : 93gEDTANa,10g NaOH,定容到500ml 10mg/ml BSA：100mgBSA于9.5ml 水中

注意:⑥⑦⑧项都用第⑤项提取的酶进行测定。 ⑥ SOD活性的测定（未做）

试验器械和试剂

仪器：离心机；光照培养箱；电子天平；U2800紫外分光光度计；研钵；塑料离心管（5mL） 试剂：

SOD反应液：0.013 mol·L－1甲硫酸铵，63×10-6 mol·L－1氮蓝四唑，6.5×10-6 mol·L－1核黄素，1×10-4 mol·L－1EDTA及pH7.8的0.05 mol·L－1磷酸缓冲液

1/15mol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8） 试验方法

光照情况下核黄素在水溶液中产生过氧活性自由基，此活性自由基将氮蓝四唑还原生成紫蓝色物质，SOD能清除溶液中产生的过氧活性自由基团，从而抑制氮蓝四唑的还原反应[76]。通过测定560nm处被抑制的吸光值百分比计算酶活性。公式如下：

ΔA560%·V 50%·W·T·v

其中：

ASOD：酶活性

ΔA560%：560nm处被抑制的吸光值百分数

ASOD = 3

V：提取的酶液总体积 v：反应的酶液体积 T：反应时间（min） W：植物材料粉末的净重

称取0.15g液氮速冻后研磨成粉末状的植物材料，放入5mL塑料离心管内加2.5mL1/15mol·L－1

磷酸缓冲液（pH7.8）超声处理1min，冰浴5min，12000rpm离心6.5min，将上清液转移至另一5mL塑料离心管内放入4℃冰箱储存待测。取上清液50µL，加950µL1/15mol·L－1磷酸缓冲液

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（pH7.8）（即：将酶液稀释20倍），再加3mL反应液（0.013mol·L1Met，63×10-6氮蓝四唑，1.3×10－6－1－4－1－1mol·L核黄素，1×10mol·LEDTA和0.05mol·L磷酸缓冲液，pH7.8）定溶至4mL，30℃、6级光照培养箱内反应10min后立即测定吸光值，用不加酶液的反应液（1mL1/15mol·L－1磷酸缓冲液，3mL反应液）作对照调零。将测得吸光值代入上式，求得酶活性。

⑦ POD活性测定（未做）

试验器械及试剂

仪器：离心机；水浴锅；电子天平；U2800紫外分光光度计；塑料离心管（5mL）；研钵 试剂：0.1mol·L－1愈创木酚；0.8%H2O2溶液；0.01mol·L－1磷酸缓冲液（pH7.2）；0.1mol·L－

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磷酸缓冲液（pH7.2） 试验方法

POD活性是通过测定H2O2存在情况下单位时间内过氧化物酶（POD）催化底物愈创木酚为茶褐色产物的量来定义酶的活性单位。用分光光度计测定470nm处反应溶液的吸光度，以每分钟每克鲜重材料的吸光度变化0.01所需的酶量为一个酶活性单位。具体过程参照朱广廉编撰的《植物生理学实验》中的方法[77]。酶活性计算公式为：

Apod=100×ΔA470V/(W·T·v)

其中：Apod：酶的活性

ΔA470：470nm处反应溶液的吸光度变化值 V：提取酶液的总体积 v：反应酶液的体积 W：样品粉末的净重 T：反应总时间

称取0.5g左右液氮速冻后研磨成粉末状的植物材料，放入5mL塑料离心管内加2.5mL0.01mol·L－1磷酸缓冲液（pH7.2）超声处理1min，冰浴5min，12000rpm离心6.5min，将上清液转移至另一5mL塑料离心管内放入4℃冰箱储存待测。

取上述提取的酶液100mL加0.01mol·L－1磷酸缓冲液（pH7.2）900mL（即将酶液稀释10倍），再加1mL0.8%H2O2溶液、1mL0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7.2）和1mL0.1mol·L－1愈创木酚溶液，充分混匀，30℃水浴反应10min，迅速在470nm处测吸光值，用超纯水替代H2O2溶液的反应体系作为对照。

⑧ 过氧化氢酶CAT（未做）

德]B．施特尔马赫著．钱嘉渊译．酶的测定方法[M]．第1版．中国轻工业出版社，1992． p186-188

1) 原理：CAT催化H2O2 分解，240nm处检测H2O2 减少量。CAT以PH7.0，37度时活性最高，

冷冻，阳光，氧气降低酶活。

2) 药品：0.18%H2O2 ：600ul 30% H2O2 用PH7.0 PBS稀释至100ml.现配。 （一般情况下，配置的双氧水冬天两周用完，夏天一周，避光） 25度预热的蒸馏水

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3) 步骤：

a) 为检查在不加酶的情况下吸光度是否也降低，以蒸馏水为参比，用移液管将1.0ml底物

溶液和1.9ml蒸馏水滴入一只1厘米比色皿，并调水温至25℃。在连续5分钟内240nm处测定吸光度，若吸光度的降低幅度超过0.01，则在计算主值时须减去此值。

b) 以蒸馏水为对照，实验组：1ml0.18%H2O2 +1.9ml蒸馏水+100ul酶液，在连续5分钟内

240nm处测定吸光度。（每隔1分钟读取一次结果，直至每分钟吸光度的降低值达到稳定为止）

c) 计算：在上述条件下，每分钟酶促分解1umol过氧化氢的酶量定为1个酶活力单位。

U/mg = E240×3 ／ 0.0436×Ew

式中：E240—240nm处每分钟内吸光度的降低值 Ew—每0.10ml所用酶液中含酶的重量（mg） 0.0436—240nm处1umol过氧化氢的吸光度 3—反应混合液的总体积。

4) 注意：酶液浓度应为5-20u/ml

⑨ 盐胁迫处理后脯氨酸含量的测定（不做）

试验器械及试剂

仪器：U2800紫外分光光度计；水浴锅；离心机；电子天平；石英比色皿；5ml塑料离心管；研钵

试剂：

脯氨酸标准液：40μg·mL-1，加蒸馏水溶解即可。 脯氨酸提取液（20 mL）：99.5%甲醇12 mL+99.5%三氯甲烷5 mL+蒸馏水3 mL

1%茚三酮溶液：精确称取1g茚三酮用乙醇溶解后，加入10 mL99.8%冰醋酸，用乙醇定容至100 mL即可。

试验方法

植物体内脯氨酸含量测定采取徐晓峰等[74]人的方法并作如下修改[75]。分别向5mL塑料离心管内加入0mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL和0.9mL40μg·mL-1脯氨酸标准溶液，用超纯水补充体积至2mL后加入1mL冰醋酸和1mL1%的茚三酮溶液，总体积为4mL。80℃水浴40min后冷却至室温，用加0mL标准液的反应溶液调零，在520nm处测吸光值（A）。用吸光值与标准脯氨酸含量作标准曲线：

Ypro=17.691*Apro+3.087

r=0.991 其中：Ypro为反应液中脯氨酸含量（μg）

A520为520nm处溶液的吸光度

r为相关系数。

取一定量的植物材料放入研钵内，加液氮，迅速研磨成粉末状，称取0.2g左右的样品粉末放入5mL塑料离心管内，加2.5mL提取液（水：甲醇：氯仿3：12：5）超声处理5min，加1mL氯仿，10000rpm离心5min，将上层溶液转移至另一离心管内，加1mL水，重复用氯仿萃取2次。取1mL上清液，加1mL冰醋酸、1mL超纯水和1mL1%茚三酮溶液后80℃水浴40min，冷却至室温，在520nm处测定吸光值，将测得吸光值带入上式求得脯氨酸的量。

徐云刚

2009年9月整理

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