油菜素内酯对甘草性状及7种化学成分含量的影响

油菜素内酯对甘草性状及7种化学成分含量的影响

作者：乔晶 胡峻 李妍芃 任广喜 项妤 臧艺玫 刘勇 刘春生 来源：《中国中药杂志》2016年第02期

[摘要]该文以两年生乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis植株为试验材料，于甘草生长旺盛的7月喷施4种不同质量浓度（0.1，0.4，0.7，1.0mg.L-1）的油菜素内酯，分别于8，9，10月取样测量其性状（株高、地茎、节数、节间高度、根长、根粗、根鲜重、根干重），利用HPLC检测7种化学成分（甘草酸、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、芹糖基甘草苷和芹糖基异甘草苷）的含量，分析外源油菜素内酯处理后栽培甘草的性状及7种成分含量的动态变化，为提高栽培甘草的产量和质量提供参考依据。结果表明，0.7mg·L-1的油菜素内酯处理2个月后，其株高、地茎、根长、根粗、根鲜重、根干重均比对照提高，其提高幅度为15.09%，6.15%，16.52%，8.46%，21.90%，29.41%；其化学成分除异甘草素外，甘草酸，甘草苷，异甘草苷，甘草素，芹糖基甘草苷，芹糖基异甘草苷分别比对照提高20.16%，45.31%，53.56%，27.66%，23.54%，8.46%。并且BR对栽培甘草的作用在处理完2个月后达到最佳值。说明外源喷施BR可以同时提高栽培甘草的产量和质量。 [关键字]栽培甘草；油菜素内酯；甘草酸；性状；药材质量

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、胀果甘草G.inflata Bat.或光果甘草G.gla-bra L.的干燥根和根茎，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药之功效。甘草为最常用的大宗药材之一，素有“十方九草”之称，其主要活性成分为甘草酸，具有镇痛、止咳、抗炎、抗肿瘤等多种功效，在国内外市场应用广泛。近年来由于甘草的大量采挖导致甘草野生资源严重匮乏，国务院已明令禁止采挖野生甘草（国发[2000]13号），目前栽培甘草已经是主流商品，但是大部分栽培甘草存在着品质退化和甘草酸含量低等问题。

油菜素内酯（brassinolide，简称BR）被称为第六类激素，其生理效应有促进细胞的分裂与伸长、调控植物蒸腾作用、呼吸作用和光合作用、植物种子休眠与萌发、提高植物抗逆性、抗病性和抗虫性、促进植物不定根的形成和愈伤组织的生成、参与光形态建成和向地性生长、器官分化、调节开花和调控衰老等，可以作为调控植物多种生育过程的调节剂。近年来，外源BR处理在调控植物生长发育以及提高作物产质量方面有着非常重要的作用。李勇等研究表油菜素内酯对冬小麦的影响发现，从拔节期开始，喷施0.1mg·L-1的表油菜素内酯组，小麦的次生根条数高于对照，说明喷施表油菜素内酯对小麦次生根的增加有促进作用，且起身期或孕穗期1次喷施或起身期+孕穗期2次喷施0.05或0.1mg·L-1的表油菜素内酯时，小麦穗粒数、千粒重和产量均提高。李洪波等发现在火龙果盛花期和果实迅速膨大期分别喷施1.0mg·L-1油菜素内酯可增加单果重和可溶性总糖含量，提高火龙果的产量和品质。池剑亭等发现外源油菜素内酯通过促进青蒿素生物合成关键基因ADS，CYP71AV1和DBR2的表达而促进青蒿中青蒿素的合成。

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以上研究表明，油菜素内酯在植物的生长发育、提高植物初生代谢产物和次生代谢产物含量方面都有重要的作用，说明BR参与了植物各个生长过程的调控。BR对初生代谢的调控可能为其提高了卡尔文循环关键酶的活力及基因表达而提高植物的光合效率，对次生代谢产物的影响则是通过影响其合成的关键基因来起作用。但是在植物的生长过程中，往往不是一种植物激素单独发挥作用，而是多种激素互相影响、互相作用，共同调节植物的生长发育。如有研究表明，BR能够提高乙烯合成过程中的关键酶（ACC）的活性，从而提高乙烯的释放量，加速果实色素积累和成熟。在逆境条件下，BR处理能显著促进内源ABA的合成，从而提高植物的抗逆性。外源性BR可以激活转基因拟南芥根中细胞分裂素信号通路的AHK4基因的表达。说明外源BR的喷施可以调动植物体内的各激素共同作用以调控植物的生长发育。

植物激素对植物代谢、生长、形态建成等各个方面起着重要的作用，目前关于油菜素内酯的研究主要集中在粮食、瓜果、蔬菜等领域，在药用植物的研究中应用较少。故本实验通过在甘草生长比较旺盛的7月，外源喷施4种不同浓度的油菜素内酯，从喷施至最后一次采收，期间通过多次取样，测量甘草的性状指标及7种次生代谢产物动态的变化，以期在保证产量的同时，为人工调控甘草次生代谢产物的含量提供理论基础。 1 材料

Agilent 1200液相色谱，安捷伦液相色谱系统化学工作站；Agilent TC-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；R200D型电子分析天平（1/10万，德国Sar-torius公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（中国昆山市超声仪器有限公司）；

甘草酸、甘草苷对照品购自中国食品药品检定研究院，异甘草昔、甘草素、异甘草素对照品购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，芹糖基甘草苷、芹糖异甘草苷购自上海慕远生物科技有限公司，7种对照品纯度均≥98%；BR为北京鑫科奥商贸有限公司产品；用于提取的乙醇为国产分析纯；HPLC流动相：色谱级乙腈，品牌为Fisher；色谱级纯磷酸，品牌为Sigma-SIAL。 2 方法

2.1 甘草外源激素的处理及取样

2014年5月从甘肃采集一年生甘草种苗若干，选取根长、根粗、根重比较一致的300余株，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为豆科植物乌拉尔甘草G_uralensis。在北京中医药大学药用植物园进行了盆栽，盆栽基质为河沙和有机肥（比例为3：1），盆的规格为380mm×410mm，每盆栽8株，所有盆栽的均采用统一、无差别管理。

于甘草生长比较快速的7月中旬向叶面喷施不同浓度的植物生长调节剂BR。参考外源BR对其他物种的效果，其质量浓度梯度设为0.1，0.4，0.7，1.0mg·L-1。喷施时，于16：00左右

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进行，以叶片湿润，叶尖挂水珠为标志；隔1d后的相同时间再用相同的方法喷洒1次，重复3次，以喷施清水为对照，如6h内遇降雨重新喷施。

为了研究不同处理对甘草次生代谢积累过程中的动态变化，以最后一次喷施后1个月开始取样，以后每隔1个月取1次样为原则，故分别于8月20号，9月20号，10月20号共取3次样。每个处理每次取16株独立样本。 2.2 供试样品的收集及性状测量

按照上述取样时间，每次处理的每个浓度取16株甘草，卷尺测量其株高、根长，电子游标卡尺测量其地茎（芦头以上第3节处）、节间高度、根粗（芦头以下1cm处），数出地上部节数，天平称其根鲜重及烘干后的根干重。测量完成后，剪去地上部分，去掉芦头、须根，60℃烘干，粉碎混匀并过60目筛。 2.3 化学成分含量测定

采用波长切换高效液相色谱法（HPLC）对已有文献的方法进行改进，同时测定了甘草中7种化学成分含量。

甘草粉末烘干，恒重，精密称取0.20g，置150mL具塞锥形瓶中，加入50mL70%乙醇，密塞称定，超声处理30min，放冷到室温，用70%乙醇补足失重，摇匀后过0.45μm滤膜，取滤液即得。

流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），梯度洗脱，0～8min，20%A；8～30min，38%A；30～42min，50%A；检测波长237nm（0～15min，芹糖基甘草苷、甘草苷），365nm（15～23min，芹糖基异甘草苷、异甘草苷），237nm（23～30min，甘草素），370nm（30～37min，异甘草素），237nm（37～42min，甘草酸）；流速1mL·min-1；柱温30℃；进样量10μL。

7种成分的对照品及样品色谱图见图1，线性关系见表1，精密性、重复性、稳定性、加样回收率均符合要求。 2.4 数据分析

利用EXCEL和SPSS20.0进行数据统计与分析，并进行作图。 3 结果与分析

3.1 不同浓度外源BR处理后对甘草性状的影响

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3.1.1 不同浓度外源BR处理后对甘草地上部分性状的影响不同浓度外源BR处理后1个月，其株高、地茎、节间高度均高于对照组，节数与对照之间并无差异，见表2。说明其株高的增加主要是由于各节之间的长度增长引起的。其中0.7mg·L-1的BR处理效果最为明显，其株高、地茎分别比对照高出10.99%，51.35%。但各组之间的差异并不显著。

处理后2个月，0.1，0.7mg·L-1的处理组，节数也比对照略有增加，节间高度比对照略有降低，但其株高、地茎仍高于对照组，其中0.7mg·L-1处理组的株高、地茎比对照高出15.09%，6.15%，节数比对照平均多出3节，并且其株高显著高于对照组（P

处理后3个月，0.1，0.7mg·L-1的处理组，其株高、地茎比对照组均有提高，其中以0.7mg·L-1的处理组效果明显，其相比对照提高幅度为12.65%，14.42%。通过对比3个取样时期地上部的性状数据发现，10月20日取样时的株高明显比前2次低，地茎值也略有下降，其原因为，10月取样时，甘草地上部叶子几乎全部脱落，此时地上部分干枯现象也十分严重，部分出现茎断裂等现象。因此，如果是农业上利用甘草的地上部分，建议在9月份采收，以达到产量最大化。

3.1.2 不同浓度外源BR处理后对甘草地下部分性状的影响 不同浓度外源BR处理1个月后，0.1，1.0mg·L-1处理组的根长、根鲜重以及烘干后的根干重均大于对照组，见表3。根干重分别比对照高出25.12%，20.80%，但其根粗显著低于对照组（P

处理2个月后，各处理组根长、根粗、根鲜重及根干重都较对照有不同程度的提高，其中以0.1，0.7mg·L-1处理组提高幅度较为明显，0.7mg·L-1处理组其根长、根粗、根鲜重、根干重分别比对照提高16.52%，8.46%，21.90%，29.41%。且各处理组根干鲜比明显高于对照组。 处理3个月后，各处理组根长、根粗与对照相比，变化并不明显，0.4，1.0mg·L-1处理组的根鲜重、根干重均高于对照组，而0.1，0.7mg·L-1处理组则低于对照，分析其原因，可能为外源BR经叶片吸收向根中转运完成后，对根的作用持续不到3个月的时间，故此次取样的各组间与对照间的作用规律并不显著。

3.2 不同浓度外源BR处理后对甘草化学成分含量的影响

3.2.1 不同浓度外源BR处理后对甘草酸和甘草苷的影响3个取样时期不同浓度BR处理后甘草酸、甘草苷的含量变化，见图2，3。可以发现，BR处理1个月后，各处理组甘草酸、甘草苷的含量均比对照有所提高，其中0.4mg·L-1的处理组在处理完1个月后效果较其他组明显，其甘草酸、甘草苷含量相比对照组，提高幅度为6.71%，10.99%，其质量分数为1.35%，0.88%。0.7mg·L-1的BR处理2个月后，其甘草酸和甘草苷的含量较对照有大幅度的提高，其提高幅度分别为20.16%，45.31%，此时二者含量分别为1.23%，0.82%。随着处理时间的延长，到第3次取样时，各处理组甘草酸和甘草苷的含量（除0.1mg·L-1处理组的甘草苷）均低于对照，以0.7mg·L-1处理组下降最明显，结合性状数据，分析其可能的原因为BR对甘草的

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作用有一定的时间局限性，处理完2个月达到其效果的最佳值，随着时间再延长，BR对甘草的刺激作用逐渐减弱。

而比较不同浓度对甘草酸和甘草苷的影响时发现，0.7mg·L-1处理组的含量变化趋势与其他几组有明显的不同，对于激素而言，不同植物的不同器官对不同激素有不同的浓度效应，激素作用效果的普遍规律为按照浓度的升高显现从提高到抑制的过程，0.7mg·L-1的处理组在9月份其他各种含量都下降的同时，能保持甘草酸和甘草苷含量上升的趋势，说明适宜浓度的BR刺激有抵御甘草中次生代谢产物含量下降的作用。

3.2.2 不同浓度外源BR处理后对其他5种黄酮类成分的影响分析不同浓度外源BR处理后对栽培甘草中其他5种黄酮类化学成分的影响发现，甘草素和异甘草素在0.4mg·L-1的BR处理完1个月后较对照提升幅度最大，幅度为39.66%，58.54%，质量分数为0.60%，0.32%。处理完2个月后，0.7mg·L-1的处理组异甘草苷含量比对照提高53.56%，质量分数为0.15%，0.1mg·L-1的处理组芹糖基甘草苷，芹糖基异甘草苷含量比对照提高29.46%，26.69%，含质量分数为0.18%，0.71%，见表4。综合对比5种成分含量发现，0.7mg·L-1的BR处理2个月后可以使各成分整体协调的上升，除异甘草苷含量比对照大幅提高外，其甘草素，芹糖基甘草苷，芹糖基异甘草苷也比对照提高27.66%，23.54%，8.46%。而处理完3个月后取样，各组含量整体上比对照呈下降趋势，此结论与性状及甘草酸、甘草昔的一致。 3.3 栽培甘草中7种成分之间的相关关系

利用SPSS软件对栽培甘草7种化学成分之间进行相关分析见表5，发现与甘草酸含量达到极显著相关（P0.8）；甘草素与甘草酸含量达到显著相关（P-1的BR处理2个月后其他6种成分都明显比对照提高的同时，异甘草素比对照略有下降的现象。 4 讨论

4.1 BR对甘草性状的影响

研究发现，与细胞分裂素GA通过引起细胞变大而引起伸长的机制不同，BR在有效浓度很低的情况下具有双重的反应——伸长与分裂，即BR在促进生长的过程中具有双重的作用——纵向伸长和横向扩展。本文通过研究表明0.7mg·L-1的BR处理栽培甘草，可使其株高、地茎明显升高，与前人研究结果相一致。 4.2 BR对甘草酸积累的作用机制

《中国药典》2010年版将甘草酸和甘草苷作为甘草质量的衡量标准，认为在一定范围内，甘草酸含量越高，甘草质量越好。甘草酸属于三萜类化合物，经过甲羟戊酸（MVA）途径合成，植物体内的油菜素内酯主要通过C-6氧化途径合成的，分析二者的合成途径可知，甘草酸合成途径的前体物质β-香树脂醇与油菜素内酯合成途径的前体物质环阿罗醇之间存在共同的作用底物2，3-氧化鲨烯。故推测BR和甘草酸合成途径之间存在反馈调节的作用，外源喷

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施BR引起内源BR含量的升高，使其共同作用底物2，3-氧化鲨烯含量增加，进而提高了甘草酸合成途径的代谢。这种类型的调节机制在葡萄中已得到验证，如当葡萄中内源激素脱落酸的水平升高时，花青素的另一合成路线的含量增加。另一种可能的原因为油菜素内酯作为一种植物生长调节剂，它对启动子序列中含有E-box（CANNTG）元件的基因具有明显的调控作用，甘草酸合成途径中的关键基因有可能存在此序列元件，从而使甘草酸生物合成的一些基因表达上调而增加其终产物的合成量，此类型的调节机制已在药用植物青蒿中得到验证。但具体BR对甘草酸积累属于哪种调节机制还需进一步的实验来验证。 4.3 BR作为植物生长调节剂具有独特的优势

BR促进植物生长的靶区域是细胞的细胞壁，通过各种机制（XET、微管）促使细胞壁松弛，使细胞体积扩大，从而摄入水分和养分。油菜素甾体激素高效、广谱、无毒，用量极微就可以发挥良好的效果，如外源喷施BR的质量浓度一般集中在0.1～1mg·L-1，几乎为其他五大类激素用量的千分之一，以脱落酸（ABA）为例，其作用浓度则需达到10～300mg·L-1的剂量。

4.4 BR在甘草体内的残留

施用外源调节剂后其残留是另外一个人们关心的问题，天然油菜素内酯是中国唯一一个通过绿色食品生产资料认证的调节剂类化学物，其在土壤中的降解半衰期为13.8～40d，且本文的研究表明，BR在喷施3个月后对栽培甘草的作用几乎不存在，如果要持续BR的作用，推测需要在适宜的时间再次补喷，此假说与李勇等的研究相一致.由于植物激素在植物体内含量极低，一般每克植物组织鲜样中的含量仅为1～100ng，易被光解、热解和氧化，且

《GB/T2763-2014食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》公布的387种农药中未把油菜素内酯作为检测项。并且越来越多的研究表明BR参与作物农药残留的降解过程，对作物进行外源BR处理能够缓解残留农药如多菌灵、百菌清、氯氰菊酯等对作物的伤害作用，所以外源油菜素内酯的施用对于农药降解是一种广泛有效、对环境友好的途径。 4.5 展望

目前，激素对甘草影响的研究主要集中在甘草种子萌发、甘草愈伤组织、甘草品质等方面，但是关于自然环境下油菜素内酯直接作用于甘草则未有报道。近年来，植物激素作为抗逆信号分子已被越来越多的学者所认同。本文通过叶片喷施BR的方法，证明了直接喷施BR可以被甘草叶片吸收，并且在甘草体内进行转移，在促进其产量的同时，使其主要化学成分含量得到提高。但本文在研究外源BR处理对甘草化学成分影响的同时，并未对其相应的内源激素的含量进行测定，因此，下一步开展内源激素动态变化与甘草中化学成分的相关关系的研究具有重要的学术意义和应用价值。 [责任编辑 吕冬梅]

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