高效液相色谱

高效液相色谱荧光紫外串联测定土壤中16种多环芳烃

中华首席医学网 2007年07月20日 08:30:57 Friday

作者：饶竹* 李松 何淼 苏劲

作者单位：国家地质实验测试中心，北京 100037;中国矿业大学资源与安全工程学院，

北京 100083

《分析化学》医学期刊（新）2007年7月7卷7期 研究报告

【摘要】 采用高效液相色谱荧光紫外检测器串联测定土壤中16种多环芳烃。通过液相色谱柱、荧光激发和发射波长等条件的优化,实现16种多环芳烃组分基线完全分离来和15种多环芳烃荧光高灵敏度检测，并通过荧光紫外串联检测来提高定性的准确度等。在优化的实验条件下，荧光检测器的检出限为0.015～0.8 μg/L；紫外检测器检出限为0.4～30 μg/L；方法精密度为0.58％～1.36%(荧光)、1.13％～5.48%(紫外)；样品加标回收率为76.4％～111%。

【关键词】 多环芳烃，土壤，高效液相色谱法，荧光法，紫外检测法

1 引言

多环芳烃（PAHs）是一类重要的环境污染物，数量多达几百种，其中16种PAHs由于存在显著的致畸、致癌、致突变作用，被美国环保署列为优先控制污染物。目前，中国只将7种列为优先污染控制物。但随着我国国民经济高速发展和环保意识增强，大气、水、土、植物等环境介质中的16种特定PAHs含量、分布及其来源的研究已成为近年我国环境

污染物研究领域中的热点和重点课题[1～６]。16种PAHs化学性质相近，大多数沸点较高，加之土壤样品中PAHs为痕量水平，样品基体组成复杂、基体干扰严重。因此，土壤中16种特定PAHs的灵敏、准确分析很困难。目前，16种特定PAHs分析主要有气相色谱（GC）、气相色谱质谱联用（GC

MS）和高效液相色谱（HPLC）３种分析手段。气相色谱分

析高沸点的PAHs存在一定困难，主要原因是分析温度已接近所使用分析柱、色谱炉的极限温度，缩短了分析柱和仪器使用寿命，降低了分析灵敏度和分析精度；另外毛细管柱对性质相近的同分异构体苯并（a）蒽和，苯并（k）荧蒽、苯并（b）荧蒽、苯并（j）荧蒽仍不能完全分离，各组分准确定量很困难；更重要的是氢火焰离子化检测器对PAHs有较低的响应值。GC

MS则利用了GC的高分离能力和质谱的高灵敏、高鉴别能力，特别是

选择离子扫描定量测定PAHs，其仪器检出限可以达2×10－9，是近年环境样品中痕量PAHs分析的主要手段。但是GC

MS分析也存在样品分析温度较高，组分分离不尽理

想的困难。HPLC分析不需要汽化，适用于沸点较高的组分分析，特别是HPLC与荧光检测器（FLD）联用，对PAHs这类含有荧光特性物质有很高的选择性和灵敏度。15种PAHs仪器检出限在1×10－10~1×10－11，是分析PAHs理想的检测手段[７，８]。HPLC色谱柱分离16种PAHs只能用分析灵敏度低的紫外检测或优化不佳的荧光波长检测，分析灵敏度不高而限制了HPLC在环境样品中的应用[9，１０]。本实验通过色谱柱优化，实现了各组分的完全基线分离。特别是荧光分析条件的优化使15种PAHs均能用荧光检测，其检出限与文献值相比下降1～2数量级[9，１０]，完全满足土壤等环境样品中超痕量15种PAHs定量分析的需要。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂LC10Avp/SPD

Vpseries 高效液相色谱仪、RF10Axl荧光检测器和SPD

10AVvp紫外检测器（日本岛津公司）；Waters PAH C18, 填料粒径为5 μ

PAH, 填料粒径为5 μm，

m，250 mm×4.6 mm不锈钢柱（德国Waters公司）。LC

250 mm×4.6 mm不锈钢柱（美国Supelco公司）。硅胶净化柱，规格30 cm×10 cm 。

氮吹仪（北京康林公司）。K.D浓缩（自己设计）。HPLC级乙腈，农残级二氯甲烷、正己烷。乙腈、二氯甲烷和正己烷均需作溶剂空白实验，满足要求后才可使用。无水硫酸钠，500℃马弗炉烘4 h，冷却后存放在干燥器中备用。NaCl 450℃烘箱烘4 h后使用。硅胶０．１５４ mm粒径或0.098 mm粒径，使用前置于一个浅盘中于130℃活化至少16 h，用金属铝箔覆盖，冷却后存放在干燥器中。Supelco16种TCL PAHS Mix标准溶液 ，萘、苊、二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并（a）蒽、、苯并（b）荧蒽、苯并（k）荧蒽、苯并（a）芘、茚并（1.2.3mg/L。替代物1

Cd）芘、二苯并（a.h）蒽、苯并（g.h.i）苝等，浓度各 2000

氟萘，1 g/L甲醇溶液。实验条件：A泵：乙腈；B泵：水；柱温：30℃；

流速：1.5 mL/min；进样量：20 μL；紫外波长：280 nm；梯度洗脱程序（见表１）。

2.２ 样品提取准确称取10.00 g土壤样品置于小烧杯中，加入10 g无水硫酸钠100 mg/L 1

氟萘替代物，搅拌均匀，无损移入滤纸筒内，上部盖一片滤纸，将滤纸筒装入索

氏提取器中。在平底烧瓶中加入80 mL正已烷丙酮（1∶1）溶液。其中用20 mL溶液浸泡土壤样品12 h后，在70℃恒温水浴上加热提取6 h。

表1 梯度洗脱程序（略）

Table 1 gradient elution procedure

待提取液冷却后，将其移入250 mL的分液漏斗中。用1% Na2SO4溶液50 mL萃取，振摇1 min待静止分层后，弃去下层丙酮水溶液。再用50 mＬ的2% Na2SO4溶液萃取２次，振摇1 min，待静止分层后，弃去下层丙酮水溶液。留下的正已烷提取液待净化。

2.３ 样品净化上述提取液放入150 mL三角瓶中，加3 g无水硫酸钠，稍稍振动后放

置至少30 min，之后过滤至梨形瓶中。经K.D浓缩仪浓缩至约3 mL，转移到试管中。用N2吹脱浓缩至0.5 mL加入2 mL正己烷，N2吹脱浓缩0.5 mL，再加入2 mL正己烷，再重复1次，最后定容到2 mL。上述样品完全转移到事先已用25 mL正己烷淋洗过硅胶柱上，再用2 mL正己烷来定量完全转移。在硫酸钠层刚刚露出空气之前，加25 mL正己烷淋洗硅胶柱，弃去流出液。然后用25 mL二氯甲烷正己烷（2∶3, V／V）淋洗硅胶柱，淋洗液收集在30 mL K.D浓缩瓶中，N2吹到0.5 mL，加乙腈2 mL，再次N2吹到0.5 mL，再加乙腈2 mL，重复2次，最后用乙腈定容到10 mL，HPLC检测。

3 结果与讨论

3.1 分析柱的优化液相色谱柱与毛细管气相色谱柱相比分辨率差，特别对性质相近如同分异构体的分离显得尤为困难。本实验选用了Sueplco和Waters公司的专用柱进行了对比研究，图1a和图１b分别为Sueplco公司和Waters公司高效液相色谱柱荧光检测器检测15种PAHs所得的液相色谱图。从图上看，两种柱的分辨率相差不大,均能完全分离16种PAHs，只是Waters柱在分离苯并[g,h,i]苝、茚并[1,2,3

cd]芘时略优于Seuplco

cd]

柱，两种组分达到完全基线分离，有利于波长的切换，使苯并[g,h,i]苝、茚并[1,2,3

芘检测波长最佳化。同时Waters柱大多组分的检出限也比Seuplco柱低，对常规分析来讲两种专用分析柱均可以用于环境样品中痕量PAHs的分析。两种分析柱的紫外检测与荧光检测具有相似的分离、分析行为，16种PAHs均有响应，可实现16种PAHs全组分测定，但检出限远远高于荧光检测器。

图1 Supelcosil LC环芳烃液相色谱图（略）

PAH柱（a）和Waters PAH C18柱（b）荧光检测15种多

Fig.1 Chromatogram of polycyclic aromatic hdrocarbons (PAHs) by

fluorescence detection for Supelcosil LCcolumn(b)

PAH column（a）and Water PAH C18

1.萘（naphthalene）；2. 1氟萘（替代物）(1 floronaphthalene（surrogate）)；

3.二氢苊或苊（acenaphthylene or acenaphthene）； 4.芴（fluorene）；5菲

（phenanthrene）；6.蒽（anthracene）；7.荧蒽（fluoranthene）；8.芘(pyrene)；9.苯并[a]蒽(benzo(a)anthracene)；10. (chrysene)；11.苯并[b]荧蒽

（benzo(b)fluoranthene）；12.苯并[k]荧蒽（benzo(k)fluoranthene）；13.苯并[a]芘（benzo(a)pyrene）；14.二苯并[a,h]蒽（dibenzo(a.h) acenaphthene）；15.苯并（[g,h,i]苝（benzo(a)[ghi]perylene）；16.茚并[1,2,3acenaphthene）。

cd]芘（indeo[1,2,3

cd] pyrene

3.2 分析条件的选择 通过文献资料和实验，优化出除二氢苊外其它15种PAHs的激发波长和发射波长（表2），实现了15种PAHs能用高灵敏度的荧光检测器检测，与文献[9，１０]相比，显著降低了仪器检出限（表2）。二氢苊没有合适的激发和发射波长，测定采用紫外检测。样品分析采用荧光、紫外串联检测，保证16种PAHs组分均能定量分析，同时双检测器有助于排除干扰，提高定性的准确性。为了定量、快速分离16种多环芳烃，方法采用二元梯度淋洗，乙腈、水为流动相，优化后的梯度淋洗程序见表1。

表2 仪器检出限、精密度和荧光检测波长（略）

Table 2 Instrument detection limit, method precision and analytical wavelength of fluorescence

3.3 方法的精密度、检出限及加标回收率以10 μg/L的PAHS的混合标准溶液平行

测定10次，计算相对标准偏差RSD。以3倍噪声对应浓度作为仪器检出限。仪器的检出限、精密度见表2。从表2看出15种组分的荧光检测器检出限达到0

015～0.8 μg/L，

远低于紫外检测器检出限（0.4～30 μg /L）几个数量级。荧光检测非常灵敏，特别适用于环境样品中痕量PAHs分析。高含量PAHs分析可采用紫外检测器检测或减小进样量等手段。为了检验方法的准确性，分别进行了土壤样品加标回收实验，１６种多环芳烃加入量均为30 ng，1

氟萘（替代物）加入量为500 ng，获得了16种组分加标回收率。基体

氟萘回收率为83.7%。满足样品分析质量控制

加标回收率为76.4%～111%；替代物1

要求，表明分析方法准确可靠。样品定量分析采用外标法定量。

3.4 方法的线性范围在优化的条件下所得的荧光检测器、紫外检测器的线性方程、相关系数和线性范围见表3。从表3看出，荧光检测器、紫外检测器在线性范围内峰面积与浓度有良好的相关性，荧光检测器的线性范围小于紫外检测器，苯并[k]荧蒽由于有非常高的响应值，线性范围较窄，可通过减小进样量增大线性范围。

表3 方法校正曲线及回归分析（略）

Table 3 Parameters of regression equation for the target compounds

3.5 样品分析结果称取10.00 g样品，按实验部分样品处理，经HPLC测定，分析结果见表4。表中替代物1

FLDUVD

氟萘回收率是用来监测样品分析全过程是否存在

氟萘回收率落在

污染损失、分析测定误差等，它的控制限为30%~160%，如果样品1

控制限之内就达到分析质量控制要求。实验结果表明，方法灵敏、准确、可靠，适用于土壤中痕量PAHs分析。

表4 样品分析结果（略）

Table 4 Determination results of PAHs in soil samples

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