凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒

用)

（BIOTIN标记POD法,适用于细胞、组织样本）

使用说明书

一、TUNEL制品说明

凯基TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3

‘

－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）

特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。 本试剂盒特点

● 操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有Proteinase K 和DAB。 ● 高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。 ● 高特异性：能特异性染色凋亡细胞。 ● 快速操作：整体操作约需3小时。

● 用途广泛：可应用于组织切片、细胞样本等。 ● 方便观察：使用光学显微镜观察实验结果。

● 高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性 使用注意事项

1．使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。 2．因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。

3．为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。

4．TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片

上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。

5. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。 6. 固定好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟或至过夜，以改善细胞的渗透性。 7. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。 8. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。

9. DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。 二、TUNEL试剂盒组分

组 份 Cat: KGA702 Cat: KGA703 Cat: KGA704 储存条件 20 assays 50 assays 100 assays Equilibration Buffer Biotin-11-dUTP TdT Enzyme 50×Proteinase K Streptavidin-HRP 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20℃ 20μL 80μL 40μL 10μL 50μL 200μL 100μL 25μL 100μL 400μL 200μL 50μL -20℃ -20℃ -20℃ 4℃避光 DAB 试剂盒以外自备仪器和试剂

2mg 5mg 10 mg -20℃ 光学显微镜、37℃孵箱、微量移液器、染色湿盒、盖玻片、载玻片、染色缸。 二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等。 三、操作流程概览

样本通透性的促进 细胞涂片、贴壁细胞爬片等细胞样本 固定 TdT酶的作用下Biotin-dUTP与样本DNAD的标记反应

四、检测样本的预处理

TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件（参照

Page 9），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。 1．细胞样本的准备

操作注意事项：

1. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。 2. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。 3. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。

4. 固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备，请按上述方法配制。

五、标记和显色反应

操作注意事项：

1. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。

2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一

步反应

3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿

盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成

实验失败。

4. TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。

5. 如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。

现象 可能原因 建议 6. 苏木素复染：将切片放入苏木素染液，染色 30s-10min（根据样本做适当调整），蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s，立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡5分钟。用二甲苯浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。 六常见问题的原因及推荐解决方案

非特异性染色Biotin-dUTP的（例如：非凋非特异性结合 亡细胞的强染色） TdT酶的浓度过高 内源过氧化物酶未被封闭 光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂） 在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作用） 固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂 染色背景较高 福尔马林固定导致某些含黑色素勿使细胞干涸 在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。 用TdT dilution buffer* 作1：2——1：10稀释， 封闭液室温（15-25℃）封闭10min（封闭液： 3%H2O2溶于甲醇） 尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂 确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定 用含有dUTP和 dAPT的溶液封闭 尝试以甲醇固定，但可能会降低检测的敏感性。 前体的细胞染成黄色 内源过氧化物酶未被封闭 Biotin-dUTP的非特异性结合 样本被支原体污染 标记反应试剂（TdT酶及dUTP）的浓度过高 细胞处于高度增殖期 DAB孵育时间过长 标记率低、染如果以乙醇或甲色淡至无 醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定 减少DAB染色时间 在非高增殖期取样检测 封闭液室温（15-25℃）封闭10min（封闭液： 3%H2O2溶于甲醇） 在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。 使用支原体检测试剂盒检测，如阳性则制备未被污染的新样本 稀释50%，以降低标记反应的浓度 或福尔马林或戊二醛固定。 丢失） 过度的固定导致与蛋白过度交联 促渗条件不佳，以复染信号较弱 选择的染料不合致于试剂不能到适 达靶分子或浓度阳性对照没有DNase I的浓度过过低 信号 低 缩短固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定 增加通透剂促渗时间 用溶于0.1M醋酸巴比妥的3-5%甲基绿增加通透剂的作用温度（15-25℃） PH4.0，或苏木素复染 冷冻切片使用3U/mL的DNase I 优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间（如：以400ug/ml作用5min） 石蜡切片使用 1500U/mL的 DNase I 0.1M的柠檬酸钠70℃作用30min。 一般样本使用10U/ml DNase I 反应缓冲液：10mM Tris-HCl（ PH 7.9）， 10 mM NaCl, 5mM MnCl2, 10mM CaCl2，37℃ 反 25mM KCl2 ，应30 min，PBS洗去。 组织样本从载组织样本被酶从降低蛋白酶K的处理时间 玻片脱落 玻片消化下来 *TdT dilution buffer：60 mM KPB 缓冲液（pH7.2），150 mM KCl， 1 mM 2-mercaptoethanol， 50 % Glycerol 非离子表面活性剂

T riton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 免疫细胞化学中，Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。

30% Triton X-100的配制：

试剂：Triton X-100 28.2ml

0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4) 72.8ml

配制方法：取Triton X-100及PBS（或TBS）混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。

Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，配制BSA等。