实时荧光定量PCR直接检测粪便标本艰难梭菌tcdB基因

谢乐;许雨乔;刘成成;夏文颖;孙鹏飞;梅亚宁;崔仑标;刘根焰

【摘 要】目的 建立艰难梭菌实时荧光定量PCR检测方法,直接检测粪便标本艰难梭菌tcdB基因,并探讨其应用价值.方法 根据艰难梭菌基因组设计tcdB基因特异性引物及探针,用ATCC 43255标准株评价其敏感性,选取艰难梭菌生物学特征相近的临床菌株验证其特异性;收集2015年10-12月临床腹泻患者稀便标本115份,提取基因组总DNA后进行tcdB基因检测,并以产毒培养法为参考方法,探讨该方法的临床诊断价值.结果 荧光定量PCR法最低检测限为1×10-3 ng,并且仅特异性地扩增产毒艰难梭菌;临床样本评价荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.0％、99.1％、85.7％和98.1％.结论 实时荧光定量PCR直接检测稀便标本中的艰难梭菌tcdB基因可用于艰难梭菌相关腹泻的快速诊断. 【期刊名称】《临床检验杂志》 【年(卷),期】2016(034)003 【总页数】4页(P211-214)

【关键词】艰难梭菌;tcdB;实时荧光定量PCR;产毒培养

【作 者】谢乐;许雨乔;刘成成;夏文颖;孙鹏飞;梅亚宁;崔仑标;刘根焰

【作者单位】南京医科大学第一附属医院检验学部,南京210029;南京医科大学第一附属医院检验学部,南京210029;南京医科大学第一附属医院检验学部,南京210029;南京医科大学第一附属医院检验学部,南京210029;南京医科大学第一附属医院检验学部,南京210029;南京医科大学第一附属医院检验学部,南京210029;

江苏省疾病预防控制中心卫生部肠道病重点实验室,南京210009;南京医科大学第一附属医院检验学部,南京210029 【正文语种】中 文 【中图分类】R446.5

艰难梭菌(Clostridium difficile, CD)是一种专性厌氧的革兰阳性粗大芽孢杆菌，能在土壤及水等环境中以芽孢的形式长期存活，可通过污染的食物或水源进入人体肠腔并定植。健康成年人艰难梭菌携带率为1%～7%，当患者长期使用广谱抗生素后，肠道正常菌群生长受抑制，艰难梭菌可大量繁殖，造成艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection，CDI)。轻者呈自限性腹泻，重者可引起爆发性肠炎。艰难梭菌可产生A毒素和B毒素，分别由tcdA和tcdB基因编码。大部分的临床菌株同时产tcdA和tcdB基因，但也有部分菌株由于tcdA基因部分片段缺失而只产tcdB[1]。研究表明，艰难梭菌B毒素是引起艰难梭菌腹泻的主要原因[2]，几乎所有产毒株tcdB基因阳性。tcdB基因通常用于艰难梭菌分子检测靶基因，包括FDA批准的BD MAX Cdiff和Xpert C. difficile等多个商品化检测系统[3-4]。本研究以艰难梭菌tcdB毒素基因为靶基因，建立艰难梭菌荧光定量PCR检测方法，并以产毒培养(toxigenic culture, TC)为参比方法[5]，初步研究其临床应用价值。

1.1 菌株及临床样本 艰难梭菌ATCC 43255(tcdB+)、艰难梭菌ATCC 700057(tcdB-)、金黄色葡萄球菌ATCC 25923和大肠埃希菌ATCC 25922均购自美国菌种保藏中心。生孢梭菌、产气荚膜梭菌、梭氏梭菌、具核梭菌和肉毒梭菌来自南京医科大学第一附属医院检验学部临床菌种库，以上临床菌株均经16S rRNA基因测序及质谱双重鉴定入库。收集南京医科大学第一附属医院2015年10-12月间115份住院腹泻患者的稀便标本。

1.2 仪器与试剂 PE 7500型荧光定量PCR扩增仪(美国ABI公司)；低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；Nano-100微量分光光度计(杭州奥盛公司)；Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定系统、Vitek 2 ANC卡、GENbag厌氧产气袋和哥伦比亚血琼脂平板(法国生物梅里埃公司)；2×PCR Master Mix(大连TaKaRa公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根公司)；1×TE和Nonidet P-40(碧云天公司)。

1.3 实时荧光定量PCR扩增 根据文献[6]设计艰难梭菌tcdB毒素基因的引物和探针，引物及探针由南京金斯瑞公司合成，见表1。PCR反应体积为25 μL：2×PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，10 μmol/L探针0.5 μL，模板1 μL，RNase free ddH2O补足至25 μL。PCR循环参数：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循环45次。根据荧光信号的指数增长情况及Ct值判断扩增结果。

取100 μL腹泻患者的稀便标本，加生理盐水1.0 mL混匀，10 000 r/min离心5 min后弃上清，加100 μL自配试剂(NP-40：TE Buffer=1∶100)，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液2 μL用于荧光定量PCR扩增tcdB基因。

1.4 敏感性试验 用细菌基因组提取试剂盒提取艰难梭菌产毒株ATCC 43255核酸。进行10倍连续稀释成10～1×10-4 ng/μL，各取1 μL用于tcdB毒素基因PCR扩增，将能够得到扩增的最小DNA模板量定义为最低检测限。

1.5 特异性试验 不产毒艰难梭菌ATCC 700057以及金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、产气荚膜梭菌、梭氏梭菌、具核梭菌、肉毒梭菌为对照菌株，将菌株调2～3个麦氏浊度，用细菌基因组提取试剂盒提取细菌核酸，取1 μL用于荧光定量PCR反应，评价引物及探针的特异性。

1.6 产毒培养方法 首先进行艰难梭菌厌氧培养，然后使用普通PCR检测tcdA

和tcdB基因。艰难梭菌培养阳性并且菌株tcdA和tcdB基因阳性定义为产毒培养阳性。艰难梭菌厌氧培养采用哥伦比亚血琼脂平板，疑似菌株的鉴定采用Vitek 2 Compact ANC卡。艰难梭菌纯培养菌株tcdA和tcdB毒素基因的检测采用普通PCR，引物设计及PCR反应条件参照文献[7]。

2.1 敏感性试验 结果显示本研究设计的引物和探针可用于定量扩增艰难梭菌tcdB基因，且该方法的最低检测限为1×10-3 ng基因组DNA。见图1。 2.2 特异性试验 该检测体系仅特异性扩增产毒艰难梭菌，对非产毒艰难梭菌和临床常见的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及表型相近的生孢梭菌、产气荚膜梭菌、梭氏梭菌、具核梭菌和肉毒梭菌PCR结果均阴性。见图2。

2.3 临床样本检测结果比较 115例住院腹泻患者粪便标本荧光定量PCR直接检测艰难梭菌tcdB基因，阳性7例，阴性108例。115份标本产毒培养法检测，阳性8例，阴性107例，图3显示的是部分培养阳性菌株的tcdA和tcdB基因扩增结果。两种方法检测结果的比较见表2。以产毒培养法检测结果为金标准，荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为75.0%、99.1%、85.7%和98.1%。

艰难梭菌传统的检测方法有厌氧培养法和显色平板培养法，其优点是敏感性高，但特异性相对低，不能区分产毒素菌株与非产毒素菌株。而且培养法耗时长，不能满足临床腹泻快速诊断的要求。免疫学方法可直接检测标本中的艰难梭菌A毒素和B毒素，特异性高，操作简单，但是敏感性低且不同研究之间差异大(56%～80%)[8-10]。本研究采用Taqman探针技术，建立直接检测粪便样本艰难梭菌tcdB毒素基因的荧光定量PCR法。该方法检测时间约为2 h，不需要厌氧培养，可以实现艰难梭菌的快速诊断。荧光定量PCR法的检测下限为1×10-3 ng，能满足临床样本的检测要求。PCR体系所设计引物和探针特异性好，能区分产毒艰难梭菌和非产毒艰难梭菌，且不受肠道菌群中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和其他革

兰阳性厌氧杆菌的影响。

通过115例临床稀便标本初步应用研究，结果与艰难梭菌产毒培养法相比，其敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为75.0%、99.1%、85.7%和98.1%。本实验中出现1例荧光定量PCR结果阳性，而产毒培养阴性病例，经患者重新留取标本后产毒培养结果为阳性，认为可能标本采集和转运过程中暴露于空气的时间太长而导致培养结果假阴性。有1株艰难梭菌厌氧培养阳性，但菌株的毒素基因检测结果为阴性，属于艰难梭菌非产毒菌株，由此可见厌氧培养方法虽然敏感性高，但无法确定是否产毒。文献报道艰难梭菌分子诊断的敏感性从77.3%～97.1%不等，特异性为93%～100%[11-12]，相比而言，本研究敏感性偏低，可能与粪便标本粗提核酸作为PCR模板，可能还会残留少量抑制Taq酶活性的物质，导致PCR检测结果阴性。后续研究将加强粪便基因组DNA提取方法的改进，从而进一步提高检测的敏感性。部分商品化的分子检测试剂盒依赖专用的仪器设备。总之，本研究建立的艰难梭菌tcdB毒素基因荧光定量PCR检测方法，所需的荧光定量PCR仪属临床分子实验常备仪器，如检测敏感性得到进一步提高后，有望转化应用于临床艰难梭菌感染的快速诊断。

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