药用溶菌酶的提取

一、实验目的

1、掌握制备溶菌酶的原理。 2、掌握结晶法提取生化药物的步骤。

3、理解等点聚焦法提取生化药物的原理和步骤。 二、实验原理

对生物制药来讲，结晶不但是一种纯化手段，也是一种从溶液在得到固体溶质药物的方法。通过改变溶液的某些条件，使其中的溶质以结晶态析出的过程即为结晶。影响结晶的条件有目的物的浓度、纯度、pH值、溶剂环境、温度及时间和晶种等。

溶菌酶是一种具有消炎作用的药物。鸡蛋清中含有丰富的溶菌酶，向蛋清中加入一定量的中性盐，并调节pH至溶菌酶的等点区，溶菌酶即可结晶析出。如结晶不纯，也可重结晶。

等点聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。它的特点是在凝胶中加入两性电解质载体化合物，从而使凝胶柱上产生pH梯度。将上样物质放在这种凝胶中进行电泳，带电荷的蛋白质离子在凝胶上泳动，当泳动至凝胶的某一部位，而此部位的pH正好相当于该蛋白质的等电点时，由于蛋白质的净电荷为零即不再移动，而不同蛋白质由于等电点不同将聚焦在不同区带，从而达到分离目的。 三、实验试剂和器材 1、鸡蛋清 2、氯化钠

3、氢氧化钠 4、五氧化二磷 5、丙酮 6、磷酸缓冲液 7、溶菌酶晶种 8、丙烯酰胺 9、双丙烯酰胺 10、TEMED 11、过硫酸铵 12、两性电解质载体 13、磷酸 14、蔗糖 15、三氯乙酸 16、考马斯亮蓝 17、天平 18、pH计 19、冷冻干燥机 20、铁架台 21、显微镜 四、实验步骤

（一）溶菌酶的提纯结晶

1、将2只鸡蛋的蛋清置于小烧杯中，慢慢搅拌数分钟，使蛋清稠度

均匀，然后两层纱布滤去卵带或碎蛋壳，量计蛋清体积。

2、按100ml蛋清加5g氯化钠的比例，向蛋清内缓慢加入氯化钠粉末，边加边搅拌，是氯化钠及时溶解，避免氯化钠沉于容器底部，否则将因局部盐浓度过高而产生大量白色沉淀。

3、加完氯化钠，用氢氧化钠调pH至10.5～11.0，边加边搅拌，避免局部碱过多。加入少量溶菌酶结晶作为晶种，4℃放置数天。当肉眼观察有结晶形成后，吸取晶液一滴，置载玻片上，用显微镜观察（100x），记录晶形。

4、结晶用布氏漏斗滤得，用0℃丙酮洗涤数次，置真空干燥器（加五氧化二磷）干燥，称重。 （二）等点聚焦纯化 1、上样

分别吸取凝胶贮液2ml，两性电解质载体0.2ml，1%TEMED溶液0.7ml和溶菌酶样品1mg，置于锥形瓶中，混匀，向胶液加入0.5%过硫酸铵溶液1ml，轻轻搅拌均匀（注意避免产生气泡），制得具有两性电解质载体的等点聚焦电泳凝胶。 2、等点聚焦

将已聚合完毕的凝胶取下放入电泳槽中进行电泳聚焦。 3、溶菌酶制备

在聚焦结束后，取出凝胶对其染色脱色处理，观察溶菌酶色带位置，并用刀片截取相应位置的区带并弄碎，用0.1M pH6.2磷酸缓冲液溶解，经4000rpm离心得上清液即为溶菌酶液，备用。