一步法RT-PCR试剂盒使用说明书

Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.

一步法RT-PCR检测试剂盒 (一步法RT-PCR扩增试剂盒)

(目录号HS0612-2)

产品包装

试剂盒组成 25次(HS0612-1) Super RT/Taq Mix 2 × RT-PCR Buffer DEPC-ddH2O 25 ul ml 1 ml 100次(HS0612-2) 25 ul 2 × ml 2 × 1 ml 保存条件

-20℃

产品简介

本试剂盒是专为一步法RT-PCR 实验研制，逆转录和PCR 在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。本试剂盒包括全新高效逆转录酶、快速热启动DNA 聚合酶，同时包含适用于逆转录和PCR 扩增的反应缓冲液和实验中所必需的反应组分。经过重组表达的SuperRT 逆转录酶RNase H活性缺失，减少了逆转录反应中RNA 的降解，更容易获得全长的cDNA。该逆转酶逆转录效率高，可对少量 RNA 模板进行良好的逆转录反应。SuperRT 逆转录酶与RNA 亲合性高，能通读GC 含量高，二级结构复杂的RNA 模板，获得高产量的cDNA。PCR 反应使用的DNA 聚合酶具有扩增效率高、延伸速度快的优良性能。独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。使用该试剂盒

能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录和PCR 扩增反应。使用本试剂盒扩增得到的目的产物3′端附有一个″A″碱基，可直接用于T/A 克隆。

产品特点

1. 效率高，可以高效转录GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。 2. 耐热性及稳定性强。

3. 操作简单迅速,最大限度的避免污染。

4. 独特的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥最大功效。

使用方法

（注意：1 ng ~ 5 μg总RNA可建立20 μl反应体系，如果总RNA量大于5 μg，请按比例扩大反应体系） 1. 将 RNA 模板、引物、2 × RT-PCR Buffer、super RT/Taq Mix 和RNase-Free Water 溶解并置于冰上备用。 2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。 试剂 2 × RT-PCR Buffer 正义引物 (10 uM) 反义引物 (10 uM) 模板RNA Super RT/Taq Mix DEPC-ddH2O 25 ul反应体系 ul 1 ul 1 ul <1 ug ul Up to 20 ul 终浓度 1 × uM uM 3. 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

4. 将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，进行RT-PCR反应。 反应条件：

注意：

1）一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20 ~ 30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。

2）延伸时间根据所扩增的片段大小设定，本产品中所包含的DNA Polymerase的扩增效率为1 kb/30s。

3）可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。

5. 反应结束后取5 ul反应产物，加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。