中性粒细胞分离实验步骤

试剂与耗材：人淋巴细胞分离液、RP1640、15ml离心管4支，棉球，止血带、碘伏、采血针，5mlEDTA抗凝采血管2支。1ml枪及枪头。 分离步骤：

1. 所有试剂恢复至室温；

2. EDTA抗凝采血管收集人外周血10ml;

3. 分别将5ml外周血加入5ml人淋巴细胞分离液中（15ml离心管中进行）；注意动作轻柔缓缓加入；

4. 500g离心，30-35分钟，室温；

5. 离心后收集低带中性粒细胞，分两层，第一层为单核细胞，第二层为中性粒细胞；（若离心后分层不明显则多离心5-10分钟）

6. 将RP1640用纯水稀释为50%RP1640用于重悬中性粒细胞，恢复细胞活性。（5-10分钟）

7. 400g离心10分钟，去上清，收集中性粒细胞，重悬于RP1640中，细胞计数。

二、中性粒细胞磁珠分选

试剂耗材及设备：磁力分选器，磁柱，CD15磁珠试剂盒，磁珠分选缓冲液50ml，RP1640，1ml枪及枪头，20微升枪与枪头，15ml离心管4支，细胞计数板。 步骤：

1. 制冰，保证磁力分选器可以放入冰盒内操作，在4-8℃内进行分选； 2. 配液磁珠分选缓冲液（50mlPBS液中含2mmol/LEDTA，0.5%BSA，PH=7.2）； 3. 将上步初步分选的中性粒细胞悬液300g离心10分钟，去上清；

4. 细胞重悬于磁珠分选缓冲液中，107细胞重悬于80微升缓冲液中；（如细胞数多按倍数增加）

5. 107细胞中加入20微升CD15磁珠；充分混匀放入2-8℃避光孵育15分钟； 6. 用1-2ml缓冲液洗涤细胞/107细胞，300g离心10分钟，去上清； 7. 重悬细胞于缓冲液中，108细胞重悬于500微升缓冲液中； 8. 将磁力分选器置于冰盒中，用3ml缓冲液冲洗磁柱； 9. 将含有中性粒细胞的缓冲液加入磁柱中； 10. 用缓冲液冲洗磁柱，每次3ml，冲洗3次；

11. 除去磁场，把磁柱放置于15ml离心管上，用5ml缓冲液加压快速冲洗磁柱； 12. 离心管中收集的便是中性粒细胞；

13. 300g离心去上清，重悬细胞于10ml细胞培养液中，细胞计数。

三、细胞活力检测

步骤：

1、4%台盼蓝：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加至100ml，用滤纸过滤4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。

2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。

3、染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。（终浓度0.04%）

4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。

5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而拒染呈无色透明状。

6、统计活力：活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%

四、细胞分组铺板给药

试剂耗材及设备：六孔板2个，1ml枪及枪头，20微升枪与枪头，15ml离心管4支，细胞计数板。

1.10ml外周血大概可分出1×107个细胞； 2.分为10组：

①空白组②单PI组③单AV组

④PI、AV双染组⑤PI、AV、CD15三染组

⑥LPS1μg/ml组⑦LPS+Nec-150μg/ml组⑧LPS+Nec-15μg/ml组 ⑨Nec-150μg/ml组⑩Nec-15μg/ml组。 3.铺板，每孔1ml细胞悬液，给药，空白组给予DMSO。（LPS浓度选择1μg/ml，因为此浓度刺激中性粒细胞后出现凋亡率较低，坏死率较高。Nec-1浓度作用于神经细胞为7μg/ml-50μg/ml）

五、细胞凋亡率检测

耗材试剂：1ml枪及枪头，20微升枪与枪头，1.5ml离心管15个，凋亡检测试剂盒，CD15抗体。

1．细胞培养一段时间后（3、6、12、24、36小时），离心（2000rpm离心5min）收集细胞；

2．用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5×105细胞； 3．加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞； 4．加入5μLAV混匀后，加入5μLPI，混匀； 5．室温、避光、反应5～15min； 6．上机检测，分析结果。