第４２卷第１２期 ２０１４年６月 广州化工 Ｖｏ１．４２ Ｎｏ．１２ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｊｕｎ．２０１４ ＨＰＬＣ测定金银忍冬叶、花、果实中绿原酸的含量 李永红，姬晓灵，汪岭，陈志高 银川 ７５０００４） （宁夏医科大学公共卫生学院，宁夏摘 要：建立了反相高效液相色谱法测定金银忍冬叶、花和果实中的绿原酸含量的测定方法。利用超声波辅助提取金银忍 冬叶、花和果实中的绿原酸，采用采用反相高效液相色谱法测定金银忍冬叶、花和果实中的绿原酸含量。结果表明：在流动相为 甲醇（Ａ）：１．０％的冰醋酸溶液（Ｂ）＝２７：７３，色谱柱为Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ Ｃｏｌｕｍｎ（２５０ ｍｉｌｌ×４．６ ｍｉｌｌ，５ ｍ），流动相流速为１．０ ｍｌ＿／ｍｉｎ， 检测波长为３２７ ｎｍ，柱温为２５℃的实验条件下测定金银忍冬叶、花和果实中的绿原酸含量分别为：（３１．６４－４－２．２１）ｍｇ／ｇ， （１７．４５ ４－１．０５）ｍｇ／ｇ，（５．１４ －１．３９）ｍｇ４／ｇ，且宁夏金银忍冬植株不同部位中绿原酸类化合物的含量分布为：叶＞花＞果实。回收 率为９９．７４％，ＲＳＤ为０．２３％。所建立的方法稳定，操作简单，结果可靠。 关键词：金银忍冬；绿原酸；高效液相色谱法；超声波提取 中图分类号：０６５７．７＋２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１—９６７７（２０１４）０１２—０１２６—０４ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ Ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｌｅａｖｅｓ，Ｆｌｏｗｅｒｓ ａｎｄ Ｆｒｕｉｔｓ ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａａｃｋｉｉ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｙ０ 一ｈｏｎｇ，Ｊ１ Ｘｉａｏ—ｌｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｌｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｚｈｉ—ｇａｏ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｎｉｎｇｘｉａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｉｎｇｘｉａ Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５０００４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｅ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ，ｆｌｏｗｅｒｓ ａｎｄ ｆｒｕｉｔｓ ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａａｃｋｉ ｗｅｒｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ａ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ ｌ８ ｃｏｌｕｍｎ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ １．０％ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ａ ｍｉｘｅｄ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ３ ２７ ｎｍ．Ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ａ ｗｉｄｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｉｎ ２～８ ｇ／ｍＬ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ（３１．６４±０．０７）ｍｇ／ｇ ａｎｄ（１７．４５±０．０６）ｍｇ／ｇ，ａｎｄ（５．１４±０．２７）ｍｇ／ｇ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ，ｆｌｏｗｅｒｓ ａｎｄ ｆｒｕｉｔｓ ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａａｃｋｉｉ ｏｆ Ｎｉｎｇｘｉａ ｐｒｏｖｉｎｃｅ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９．７４％ａｎｄ ＲＳＤ ｗａｓ ０．２３％． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ，ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａａｃｋｉｉ ｏｆ Ｎｉｎｇｘｉａ ｗａｓ ａ ｇｏｏｄ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａａｃｋｉ ；ＨＰＬＣ；ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ 金银忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａ￣ｃｋｉｉ），又名金银木、鸡骨头，为忍冬 依据。 科忍冬属落叶灌木。其主要成分为绿原酸、异绿原酸、黄酮类 化合物、芳樟醇和双花醇等。有研究成果表明，绿原酸是一种 重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝 利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、抗氧化及兴奋中枢神经系统 等多种药理作用。除了药用外，绿原酸可以作为某些高级化妆 品的添加剂、植物生长激素及食品中的添加剂等，因此绿原酸 是食品、药品、化妆品等工业的重要原料。 １材料与仪器 １．１ 材料 采集宁夏医科大学校园内的金银忍冬叶；花；果实；阴 干，并保存。 １．２仪器与试剂 日立Ｌ一２０００型高效液相色谱仪，日本ＨｉＴＡＣＨｉ公司； Ａｌｈｉｍａ Ｃｌ８柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ Ｉｘｍ），Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ公司；Ａ１２０４型电子天平，ＭＥ ＴｒｒＬＥＲ 国内对其同属植物绿原酸含量的研究报道较多，如金银花 中绿原酸含量高，纯度好，是从自然界中获得绿原酸的主要原 料，但是金银花的开发利用已接近饱和。金银忍冬是金银花的 同属植物，有关金银忍冬中绿原酸含量的研究报道较少。为开 发利用金银忍冬，本试验采用反相高效液相色谱法同时测定宁 夏种植的金银忍冬叶、花、果实中绿原酸的含量，旨在为金银 忍冬中绿原酸的提取、检测提供一种快捷、准确、简单的方 ＴＯＬＥＤＯ仪器有限公司；ＫＱ３２００ＤＡ型数控超声波清洗器，昆 山市超声仪器有限公司；ＪＹＬ一１３０６０型料理机，九阳股份有限 公司；绿原酸对照品，中国药品生物制品检定所；甲醇（色谱 纯），天津赛弗瑞科技有限公司；冰醋酸（分析纯），北京化工 厂；自制高纯水。 法，为进一步研究宁夏金银忍冬叶、花、果实的药理作用提供 作者简介：李永红（１９８２一），女，讲师，主要从事生命科学中的新分析方法研究，通讯作者。 姬晓灵（１９６０一），女，教授，主要从事药物分析工作，通讯作者。 第４２卷第１２期 李永红，等：ＨＰＬＣ测定金银忍冬叶、花、果实中绿原酸的含量 表２精密度试验结果 Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ １２７ ２方法与结果 ２．１ 对照品溶液配制 准确称取绿原酸对照品０．１ ｍｇ，置于１０ ｍＬ容量瓶中，加 ５０％甲醇定溶至刻度，摇匀，得到绿原酸对照品溶液（１０ ／ｍＬ）。 即得到４ ｍＬ绿原酸对照品溶液。 ２．２样品溶液的制备 分别准确称取０．２００ ０ ｇ金银忍冬叶、花、果实的干燥粉 末置于５０ ｍＬ容量瓶中，加入３０％甲醇至刻度，摇匀，用数控 超声器提取３０ ｍｉｎ，取出，放冷，再用３０％甲醇定容至刻度， 分别取４ ｍＬ溶液用８００型离心沉淀器中以４ ０００ ｒ／ｍｉｎ的速度 由测定结果计算得绿原酸峰面积的相对标准偏差（ＲＳＤ）为 １．５９％，表明测定精密度良好。 ２．４．３稳定性试验 离心１５ ｍｉｎ，取上清液用微孔滤膜（０．４５ ｍ）滤过。 ２．３色谱条件 采用Ａｌｈｉｍａ Ｃｌ８ Ｃｏｌｕｍｎ（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ ｍ）分析 按照样品溶液制备方法制备金银忍冬果实３０％甲醇提取 液，准确吸取金银忍冬果实３０％甲醇提取物的供试品溶液 柱，流动相为：甲醇（Ａ）：体积分数１．０％的冰醋酸溶液（Ｂ）＝ ２７：７３，流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长为３２７ ｎｍ，柱温为 ２５ 。 １．５ ｍＬ置于测量瓶，超声处理１０ ｍｉｎ，按上述液相色谱条件， 供试品溶液在制备后０ ｈ、２ ｈ、８ ｈ、１２ ｈ、２４ ｈ，分别进样 １Ｏ ，测定结果如表３所示。 表３稳定性试验结果 Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｔｂｉａｌｉｔｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ２．４ ＨＰＬＣ定量分析的方法学考察¨ Ｊ ２．４．１线性关系考察 吸取“步骤２．２”所制对照品溶液２．０ ｍＬ，置于测量瓶 内，超声１０ ｍｉｎ，放冷，分别进样５．０ Ｌ，１０．０ Ｌ，１５．０ Ｌ， ２０．０ ＩｘＬ，进行高效液相色谱仪测定，结果如表１所示。 表１绿原酸标准品ＨＰＬＣ测量结果 Ｔａｂｌｅ １ ＨＰＬＣ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ 由表３稳定性试验的测量结果计算得到绿原酸峰面积的相 对标准偏差ＲＳＤ为０．６１％，表明该测定方法稳定。 ２．４．４重复性试验 称取同一金银忍冬果实样品干粉三份，按照２．２样品溶液 的制备方法制备得到三份金银忍冬果实样品溶液，照２．３高效 液相色谱分析的色谱条件，分别测定金银忍冬果实样品溶液， 以绿原酸峰面积为纵坐标（Ｙ），对照品溶液的浓度为横坐 标（ｘ），绘制标准曲线，如图１所示。 测定结果如表４所示。 表４重复性试验结果 Ｔａｂｌｅ ４ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｈｓ ｏｆ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ 由测定结果计算得到绿原酸峰面积的相对标准偏差（ＲＳＤ） 图１绿原酸标准曲线 Ｆｉｇ．１ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ 为１．６２％，表明用该方法测定的重复性良好。 ２．４．５样品加标回收率实验 表５样品加标回收率试验结果 Ｔａｂｌｅ ５ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ 绿原酸标准品回归方程为Ｙ＝６８６０．３ｘ ４－９５．４，相关系数为 Ｒ ＞０．９９９９，试验结果表明，绿原酸在０～８ ｇ／ｍＬ的质量浓 度范围内呈现良好的线性关系。 ２．４．２精密度试验 准确吸取绿原酸的对照品溶液１．５ ｍＬ置于测量瓶内，经 超声处理１０ ｍｉｎ，放冷，用高效液相色谱一连续测定５次，每 次５ Ｌ，测定结果如表２所示。 １２８ 广州化工 ２０１４年６月 准确称取已知绿原酸含量的金银忍冬果实干粉３份置于 ２５ ｍＬ容量瓶，然后分别精密加入绿原酸对照品溶液，按２．２ 节方法制备样品溶液，在上述色谱条件下测定，每份样品平行 测定３次，测定结果如表５所示。 由加样回收率试验测定结果计算得绿原酸的平均回收率为 ９９．７４％，其ＲＳＤ为０．２３％，回收率较高。加标前后色谱图见 图２、图３所示。 Ｏ．Ｏ０４ ０．００２ ０．０００ ０ ５ １０ １５ 保留时间／ｍｉｎ 图２样品加标前绿原酸色谱图 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｅｆｏｒｅ ａｄｄｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｏ ０ ０ Ｏ ０ Ｏ ５ Ｏ ５ Ｏ ５ Ｏ ５ Ｏ ㈣ ㈣ ０ ００４ Ｏ ００２ ０．０００ ０ ５ ｌ０ ｌ５ 保留时间／ｍｉｎ 图３样品加标后绿原酸色谱图 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ａｆｔｅｒ ａｄｄｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ２．４．６宁夏金银忍冬叶、花、果实中绿原酸含量的测定 Ｏ ＯＯｌ ≤０ ０００ ０ Ｏ０１ ０ ００２ 保留时间／ｍｉｎ 图４绿原酸标准品色谱图 Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ０ ２ ４ ６ ８ ｌ０ １２ １４ 保留时间／ｍｉｎ 图５金银忍冬叶色谱图 Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅ ｅｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａａｃｋｉｉ ０ ０ ２ ４ ６ ８ １ｏ １２ ｌ４ 保留时间／ｍｉｎ Ｏ ０ 一 ㈣ 图６金银忍冬花色谱图 Ｆｉｇ．６ Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅ￣ｏｆ ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａａｃｋｉｉ ０ ００４ ０．００２ Ｏ＿０００ ０ ２ ４ ６ ８ ｌ０ ｌ２ ｌ４ 保留时问／ａｒｉｎ 图７金银忍冬果色谱图 Ｆｉｇ．７ Ｔｈｅ ｅｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔｓ ｏｆ ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａａｃｋｉｉ 分别精密吸取宁夏金银忍冬叶、花、果实的３０％甲醇提取 液１ ｍＬ置于５０ ｍＬ、２５ ｍＬ、１０ ｍＬ容量瓶中，用３０％甲醇定 容至刻度。量取１．５ ｍＬ稀释后的样品溶液，用超声波仪超声 １０ ａｒｉｎ，在上述色谱条件下，种按２．２样品处理方法处理得到 的样品溶液各１０．０ 注入高效液相色谱仪，分别测定其含 量。试验结果表明：绿原酸在宁夏金银忍冬叶、花、果实均存 在（图４、图５、图６、图７），且其含量如表６所示。 由表６可知，宁夏金银忍冬叶、花、果实中绿原酸含量分 另０为：（３１．６４±２．２１）ｍｇ／ｇ，（１７．４５±１．０５）ｍｇ／ｇ，（５．１４± １．３９）ｍｇ／ｇ。所以宁夏金银忍冬叶的３０％甲醇提取物中所含绿 原酸总量最大，花次之，果实最小，表明在宁夏金银忍冬植株 不同部位中绿原酸类化合物的含量分布为：叶＞花＞果实。 （下转第１３５页） ０ 第４２卷第１２期 郭茂霞，等：不同茄子各部位中铁铜锰微量元素的测定 １３５ 中的铁元素含量明显高于紫茄子肉中的铁元素含量。铁是生物 体内含量最丰富的微量元素之一，是血红蛋白的重要组成部分 和血液中输送氧气和交换氧气的重要元素 。ｃｕ元素在绿茄 子、紫茄子中含量差别不明显；铜参与各种生理活动和代谢过 程，包括维持正常的造血机能、促进结缔组织形成、维持中枢 神经系统的健康、促进正常黑色素形成和维护毛发的正常结构 以及保护机体细胞免受超氧化阴离子的损伤 ；在绿茄、紫茄 各部位中，绿茄子蒂、紫茄子蒂中的锰元素含量较多；锰对于 维持正常的生命活动发挥着重要作用，它参与血多酶的合成与 激活，催化造血机能，调节内分泌 Ｊ。实验结果对于进一步综 合利用茄子的药用及食用价值提供了有关微量元素的参考依 据。 ［２］何伟平，王勤志，朱晓韵，等．茄子提取物对清除自由基作用的研究 ［Ｊ］．轻工科技，２０１２（４）：３—７． ［３］ 王顺民，郭红转，周丽娟，等．正交设计法优化壳聚糖涂膜保鲜紫茄 子［Ｊ］．食品科学，２００９，３０（２）：２６８—２７１． ［４］ 陈红．原子发射光谱法测１２种解表中草药中微量元素的含量［Ｊ］． 浙江中西医结合杂志，２００２，１２（５）：３２１． ［５］何燕，周国华，王学求．从微量元素与人体健康关系得到的启示 ［Ｊ］．物探与化探，２００８，３２（１）：７Ｏ一７４． ［６］ 杨梅，冯芳．中药中微量元素分析方法及其应用［Ｊ］．药学进展， ２００８，３２（２）：５６—６２． ［７］石娟．药物分析设计实验教学探讨［Ｊ］．药学教育，２００６，２２（０４）： ５１—５３． ［８］ 苑娟，王俊敏，李晓飞，等．药学专业物理化学实验教学的绿色化改 参考文献 ［１］ 刘建辉，杜新民，赵熙．茄子果实发育过程中主要营养成分动态变 化［Ｊ］．中国农学通报，２００７，２３（２）：２５９—２６２． 革［Ｊ］．药学教育，２０１１，２７（４）：５７—５９． ［９］ 荆俊杰，谢吉民．微量元素锰污染对人体的危害［Ｊ］．广东微量元素 科学，２００８，１５（２）：６—９． （上接第１２８页） 表６宁夏金银忍冬叶、花、果实中绿原酸含量的测定结果 Ｔａｂｌｅ ６ Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｅ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ， ｆｌｏｗｅｒｓ ａｎｄ ｆｒｕｉｔｓ ｏｆ ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａａｃｋｉｉ 操作简单，避免了热不稳定物质的破坏。 ３．３流动相比例的选择 色谱条件为甲醇：１．０％冰醋酸：２７：７３时，三种样品溶 液中绿原酸的色谱峰与其他物质色谱峰分离的较好，在此色谱 条件下可以较好的定性定量分析样品溶液中的绿原酸。 ４ 结论 本研究建立了反相高效液相色谱法同时测定金银忍冬叶、 花、果实中绿原酸的含量的方法，该方法简便快速，线性范围 宽，分离效果好，数据准确、可靠。 参考文献 ３讨论 ［１］张永清，徐凌川，王丽萍，等．忍冬不同部位中绿原酸的含量测定 ［Ｊ］．中国中药杂志，１９９６，２１（４）：２０４—２０５． ３．１ 提取溶剂的选择 研究表明，以３０％甲醇作为溶剂提取出的绿原酸含量高， 且绿原酸色谱峰与其他杂质峰分离的最好。 ［２］林丽美，刘菊妍，王燕，等．ＲＰ—ＨＰＬＣ法测定金银花中绿原酸的含 量［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２００９，１５（９）：２２—２３． ［３］耿世磊，徐鸿华，赵晟，等．山银花茎、叶、花中绿原酸分布规律研究 ［Ｊ］．中草药，２００４，３５（３）：３１５—３１８． ［４］ 黄雄，李萍，张重义，等．ＨＰＬＣ同时分析金银花中绿原酸和黄酮类 成分的方法处理及应用［Ｊ］．中国药学杂志，２００５，４０（１０）：７８１． ３．２提取方法选择 采用冷浸提取、回流提取和超声提取３种方法进行对比试 验，结果表明相同提取时间，超声和回流提取的量多，而超声