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(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104271147 A(43)申请公布日 2015.01.07
(21)申请号 201280065370.2(22)申请日 2012.12.27(30)优先权数据
11306784.7 2011.12.27 EP(85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.06.27
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/EP2012/076968 2012.12.27(87)PCT国际申请的公布数据
WO2013/098337 EN 2013.07.04(71)申请人巴黎第六大学
地址法国巴黎
申请人法国居里学院
(72)发明人安赫利塔·雷沃略加西亚
法里博·内马蒂 迪迪埃·德科丹热罗尼莫·布拉沃西西利亚耶稣马里亚·福米纳亚古铁雷斯(74)专利代理机构中原信达知识产权代理有限
责任公司 11219
代理人杨青 穆德骏(54)发明名称
细胞穿膜肽(57)摘要
本发明涉及细胞穿膜肽，其任选地与促细胞凋亡肽连接，可用作促细胞凋亡剂以抑制体外细胞的增殖以及治疗肿瘤。
(51)Int.Cl.
A61K 38/17(2006.01)C07K 14/47(2006.01)C07K 19/00(2006.01)C12N 9/16(2006.01)
权利要求书2页 说明书13页权利要求书2页 说明书13页
序列表9页 附图3页序列表9页 附图3页
CN 104271147 A CN 104271147 A
权 利 要 求 书
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1.包含如下氨基酸序列(I)的肽：
X1-KKKIK-ψ-EI-X2-X3(I)(SEQ ID NO：1)其中X1为空缺、赖氨酸残基或缬氨酸-赖氨酸；X2为空缺、赖氨酸残基或赖氨酸-异亮氨酸；X3为空缺或1至4个氨基酸的氨基酸序列；以及ψ为不同于精氨酸的氨基酸残基；
或者经一种或多种化学修饰衍生自序列(I)的抗蛋白水解肽，或经一个或多个保守性替换衍生自序列(I)的基本上同源的肽。
2.权利要求1的肽，其中ψ对于精氨酸而言是非保守的，优选为丙氨酸。3.权利要求1或2任一项的肽，其中X1为缬氨酸-赖氨酸；X2为赖氨酸-异亮氨酸；以及X3为空缺。4.权利要求3的肽，其为VKKKKIKAEIKI(SEQ ID NO：2)5.权利要求3的肽，其为VKKKKIKKEIKI(SEQ ID NO：10)或VKKKKIKNEIKI(SEQ ID NO：11)。
6.包含权利要求1至5任一项的肽的载体，所述肽作为细胞穿膜肽与目标分子相偶联。7.权利要求6的载体，其为包含权利要求1至5任一项的肽的嵌合肽构建体，所述肽作为细胞穿膜肽与促细胞凋亡肽融合，其中所述细胞穿膜肽优选与促细胞凋亡肽的N末端融合。
8.权利要求7的嵌合肽构建体，其中所述促细胞凋亡肽包含序列Y-X4a-ETLD-X4b-I-X5-EQWA-X6-S-X7(SEQ ID NO：3)，其中
X4a为缬氨酸或异亮氨酸；X4b为天冬氨酸或甘氨酸；X5为苯丙氨酸或亮氨酸；X6为精氨酸或组氨酸；X7为空缺或谷氨酰胺，或谷氨酰胺-天冬酰胺，或谷氨酰胺-天冬酰胺-亮氨酸；或经一种或多种化学修饰衍生自所述促细胞凋亡肽的抗蛋白水解肽，或经一个或多个保守性替换衍生自SEQ ID NO：3的基本上同源的肽。
9.权利要求8的嵌合肽构建体，其中X4a为缬氨酸；X4b为天冬氨酸；X5为苯丙氨酸；以及X6为组氨酸。
10.权利要求9的嵌合肽构建体，其为
VKKKKIKAEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL(SEQ ID NO：4)或VKKKKIKAEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL(SEQ ID NO：5)。
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权 利 要 求 书
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11.权利要求7的嵌合肽构建体，其中所述促细胞凋亡肽包含如下序列或由如下序列组成：
a)氨基酸序列DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO：8)；b)与SEQ ID NO：8基本上同源、优选与SEQ ID NO：8至少80％的同一性，且诱导细胞凋亡的氨基酸序列；或
c)诱导细胞凋亡的以及经一种或多种化学修饰衍生自a)或b)中定义的肽的抗蛋白水解肽。
12.权利要求11的嵌合肽构建体，其中所述促细胞凋亡肽包含序列DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO：9)或由序列DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO：9)组成。
13.权利要求12的嵌合肽构建体，其选自：
VKKKKIKAEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO：16)VKKKKIKKEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO：17)以及VKKKKIKNEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO：18)。14.核酸，其包含编码权利要求1至5任一项的肽或者权利要求7至13任一项的嵌合肽构建体的序列。
15.包含核酸的载体，所述载体用于基因治疗或者体内或离体基因转移，所述核酸包含(i)编码权利要求1至5任一项的肽的核苷酸序列，以及与(i)偶联的(ii)目标核苷酸序列。
16.权利要求7至13任一项所定义的嵌合肽构建体或编码所述嵌合肽构建体的核酸用于体外抑制细胞增殖的用途。
17.药物组合物，其包含权利要求15中所定义的载体，或者如权利要求7至13任一项所定义的嵌合肽构建体，以及药学上可接受的载体。
18.权利要求17的药物组合物，其用于治疗过度增生性疾病，其中所述过度增生性疾病优选是
-(i)非癌性过度增生性疾病，其选自：牛皮癣、良性前列腺肥大、风湿性关节炎、炎性肠病、骨性关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化以及口腔毛状白斑，和/或
-(ii)癌症，其选自：急性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞、皮肤T细胞淋巴瘤，以及脑癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、头癌、颈癌、肾癌、前列腺癌、结肠直肠癌、食道癌和甲状腺癌，葡萄膜黑色素瘤以及黑色素瘤；
其中所述过度增生性疾病优选肿瘤，优选人类患者的癌性肿瘤，仍然优选淋巴瘤，甚至更为优选慢性淋巴细胞白血病(CLL)；
或寄生虫疾病，其中所述寄生虫疾病优选是由于选自椎体虫属(Trypanosoma)、泰勒尔梨浆虫属(Theileria)或疟原虫属(Plasmodium)的寄生虫感染所造成的。
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说 明 书细胞穿膜肽
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本发明涉及穿过细胞膜的穿梭肽。[0002] 发明背景：
[0003] 细胞凋亡是基因方面的程序性细胞死亡，其失调与癌症及其他病理相关。尽管已知细胞凋亡依赖Bcl-2家族成员和半胱天冬酶(caspase)，近期的数据表明，两个主要的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶家族，PP1和PP2A，是参与细胞生命或细胞死亡决定的关键作用者。Ser/Thr磷酸酶PP2A参与细胞凋亡的诱导和防止两者，意味着磷酸酶行为存在复杂的相互作用。几种磷酸酶最近已经成为多种疾病(包括癌症)治疗的具有吸引力的靶标。然而，唯一靶向磷酸酶的临床药物是免疫抑制性环孢霉素A和FK506。
[0004] 细胞穿膜肽(CPP)是能够在不引起细胞膜损伤的情况下易位至细胞内的分子，这使得提出其作为递送治疗性药物的载体的用途。已经鉴定出几种CPP，例如Tat、黑腹果蝇触足肽(antennapedia)或SHV1VP22。这些肽能够穿过细胞膜，到达细胞质和/或细胞核。已经设计出与PP1/PP2A蛋白相互作用的穿膜肽。这种名为“药物磷酸酶技术”(DPT)的方法描述于Guergnon等，2006以及国际专利申请WO2003/011898和WO2004/011595中。可特异性地解除半胱天冬酶-9和PP2A之间相互作用的被称为DPT-C9h的促细胞凋亡肽(pro-apoptotic peptide)，使用了这种穿膜序列(国际专利申请WO2010/112471)。[0005] 然而，此肽半衰期很短，这对于临床应用来说是一个真正的缺陷。[0006] 发明概述
[0007] 本发明的突变肽克服了这个问题，因为其不会被人血清蛋白酶所消化。这种新的特性使得可能减少注射肽的剂量以及给药疗程。
[0008] 本发明提供了包含如下氨基酸序列(I)的肽：[0009] X1-KKKIK-ψ-EI-X2-X3(I)(SEQ ID NO：1)[0010] 其中X1为空缺、赖氨酸残基或缬氨酸-赖氨酸；[0011] X2为空缺、赖氨酸残基或赖氨酸-异亮氨酸；[0012] X3为空缺或1至4个氨基酸的氨基酸序列；[0013] 以及ψ为不同于精氨酸的氨基酸残基，
[0014] 或者经一种或多种化学修饰衍生自序列(I)的抗蛋白水解肽，或经一个或多个保守性替换衍生自序列(I)的基本上同源的肽。
[0015] 本发明进一步提供了包含所述肽的载体，所述肽作为细胞穿膜肽与目标分子相偶联。
[0016] 本发明进一步提供了包含所述肽的嵌合肽构建体，所述肽作为细胞穿膜肽与促细胞凋亡肽融合，其中所述穿膜肽优选与促细胞凋亡肽的N末端融合。
[0017] 本发明的另一个方面是包含编码细胞穿膜肽或嵌合肽构建体的序列的核酸。[0018] 本发明的另一个方面是包含核酸的载体，所述载体用于基因治疗或者体内或离体基因转移，所述核酸包含(i)编码细胞穿膜肽的核苷酸序列，以及与(i)偶联的(ii)目标核苷酸序列。
[0019] 还进一步包括了将嵌合肽构建体或编码所述嵌合肽构建体的核酸用于抑制细胞
[0001]
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说 明 书
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体外增殖。
[0020] 本发明进一步的主题是包含如本文所描述的所述载体或嵌合肽以及药学上可接受的载体的药物组合物。
[0021] 本发明进一步涉及根据本发明的嵌合肽或药物组合物用于治疗过度增生性疾病或寄生虫病的用途。[0022] 发明详述[0023] 发明人致力于提高WO2010/112471中所公开肽的稳定性，特别是受到蛋白酶降解的肽DPT-C9h。此肽对应于与半胱天冬酶-9与PP2A的结合位点的序列相关联的穿膜肽。此肽在人细胞系中诱导细胞凋亡。此外，它仅在分离自慢性淋巴细胞白血病患者的肿瘤B细胞中具有特异性细胞凋亡效应而对健康细胞则没有影响。此外，当注射到携带有人乳腺癌异种移植物的小鼠中时，该肽引起肿瘤体积的显著减小。
[0024] DPT-C9由序列VKKKKIKREIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL(SEQ ID NO：6)组成，其中VKKKKIKREIKI(SEQ ID NO：7)为穿膜肽。[0025] 发明人已经显示，穿膜肽中的一个突变极大地提高了整个肽的稳定性，同时能保持其特性，特别是其诱导细胞凋亡的能力。[0026] 根据本发明，跨膜肽中精氨酸残基的突变能防止被蛋白酶切割。[0027] 发明人因此设计了包含如下氨基酸序列(I)的肽：[0028] X1-KKKIK-ψ-EI-X2-X3(I)(SEQ ID NO：1)[0029] 其中X1为空缺、赖氨酸残基或缬氨酸-赖氨酸；[0030] X2为空缺、赖氨酸残基或赖氨酸-异亮氨酸；[0031] X3为空缺或1至4个氨基酸的氨基酸序列；[0032] 以及ψ为不同于精氨酸的氨基酸残基。[0033] 在优选的实施方式中，ψ为A、K或N。仍然优选对于精氨酸而言ψ是非保守的。因此，在优选的实施方式中，ψ是不同于赖氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的氨基酸残基。优选ψ为丙氨酸。
[0034] 在优选的实施方式中，[0035] X1为缬氨酸-赖氨酸；[0036] X2为赖氨酸-异亮氨酸；[0037] 以及X3为空缺。
[0038] 优选的肽为VKKKKIKAEIKI(SEQ ID NO：2)。[0039] 另一条肽为VKKKKIKKEIKI(SEQ ID NO：10)。[0040] 另一条肽为VKKKKIKNEIKI(SEQ ID NO：11)。[0041] 定义：[0042] 术语“患者”是指需要进行其中期望达到促细胞凋亡效应的治疗的人或非人的动物，优选哺乳动物，包括男性、女性、成人和儿童。[0043] 如本文中所使用的术语“治疗”(treatment)或“疗法”(therapy)包括治愈性和/或预防性的治疗。更具体地，治愈性治疗是指症状缓解、改善和/或消除、减少和/或稳定(例如无法发展至更晚期的阶段)中的任意一种，以及某种特定疾病症状延迟进展。[0044] 预防性治疗是指如下任意一种：中断发作、减少发展风险、减少发病、延缓发生、减
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说 明 书
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少发展，以及增加某种特定疾病的症状发作的时间。[0045] 术语“穿膜肽”或“细胞穿膜肽”(或“CPP”)或“穿梭肽”可相互替换使用，其意为该肽能够易位至细胞内而不会引起细胞膜的实质性损伤，并且当与其他分子相连接时能够用作其他分子的载体。该术语是指阳离子细胞穿膜肽，也称之为转运肽、载体肽或肽转导结构域。CPP，正如本文中所示，具有诱导与CPP融合的肽穿透给定细胞培养物群体中30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％以内的细胞的能力，并允许在全身性体内施用时使大分子易位至多个组织中，其中所述百分比包括其间的所有整数。细胞穿膜肽也可以指这样的肽，当使其在合适的条件下与细胞相接触时，能够以明显高于被动扩散的状态从外部环境穿入细胞内环境中，包括细胞质、细胞器例如线粒体或细胞核。可通过本领域技术人员所已知的各种方法来评估这种特性。
[0046] 当一个或多个氨基酸残基被生物学相似的残基所替代，或者当大于80％的氨基酸是相同的，或大于大约90％、优选大于大约95％的氨基酸是相似的(功能上相同)时，两条氨基酸序列是“同源的”、“基本上同源的”或“基本上相似的”。优选地，利用例如GCG(Genetics Computer Group，GCG软件包程序手册，版本7，Madison，Wisconsin)堆积(pileup)程序或本领域已知的任意程序(BLAST、FASTA等)通过比对来鉴定相似或同源的序列。优选地，这些同源肽不包含两个半胱氨酸残基，以防止环化。[0047] 本文所使用的术语“保守性替换”是指一个氨基酸残基被另一个所替代而不会改变肽的整体构象和功能，其包括但不限于一个氨基酸被一个具有相似特性(例如极性、氢键势能、酸性、碱性、形状、疏水性、芳香性等)的所替代。具有相似特性的氨基酸是本领域熟知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性碱性氨基酸，可互换。类似地，疏水性氨基酸异亮氨酸，可被亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸替代。可相互取代的中性亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。[0048] 本发明的“取代”或“修饰”包括由天然存在的氨基酸经过改变和修饰得到的那些氨基酸。
[0049] 因此，应当理解的是，在本发明的上下文中，保守性替换在本领域中被认为是一个氨基酸被另一个具有相似特性的氨基酸所取代。保守性替换的示例如下面表1所示：[0050] 表1：保守性替换I
[0051]
侧链特征非极性极性-不带电荷极性-带电荷芳香族其他
[0052]
氨基酸G A P I L VC S T M N QD E K RH F W YN Q D E
或者，保守性氨基酸也可如Lehninger，1975中所描述进行分组，如紧接下面的表
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2中所示。
[0053] 表2：保守性替换II
[0054]
侧链特征
氨基酸
非极性(疏水性) A.脂肪族：B.芳香族：C.含硫：D.边界：
不带电荷-极性A.羟基：B.酰胺：C.巯基：D.边界：
A L I V PF WMG S T YN QCG
正电荷(碱性)：K R H负电荷(酸性)：D E
[0055]
作为另一种替代，示例性的保守性替换如紧接下面的表3中所示。[0056] 表3：保守性替换III
[0057]
原始残基Ala(A)Arg(R)Asn(N)Asp(D)Cys(C)
示例性替换
Val(V)、Leu(L)、Ile(I)Lys(K)、Gln(Q)、Asn(N)GIn(Q)、His(H)、Lys(K)、Arg(R)Glu(E)Ser(S)
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Gln(Q)Glu(E)His(H)Ile(I)Leu(L)Lys(K)Met(M)Phe(F)Pro(P)Ser(S)Thr(T)Trp(W)Tyr(Y)Val(V)
[0058]
Asn(N)Asp(D)
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Asn(N)、Gln(Q)、Lys(K)、Arg(R)Leu(L)、Val(V)、Met(M)、Ala(A)、Phe(F)Ile(I)、Val(V)、Met(M)、Ala(A)、Phe(F)Arg(R)、Gln(Q)、Asn(N)Leu(L)、Phe(F)、Ile(I)Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Ala(A)Gly(G)Thr(T)Ser(S)Tyr(T)
Trp(W)、Phe(F)、Thr(T)、Ser(S)Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Ala(A)
肽的制备：
[0059] 本文中所描述的肽可利用本领域技术人员已知的标准合成方法来合成，例如化学合成或基因重组。在优选的实施方式中，通过氨基酸残基的逐步缩合获得肽，在缩合期间，对参与肽键形成的那些基团之外的氨基酸官能团进行保护，通过对预先形成的已经包含处于适当顺序的氨基酸序列的片段进行缩合，或者通过对预先制备的数条片段进行缩合。具体地，可根据由Merrifield最初描述的方法来合成肽。[0060] 化学合成技术的示例是固相合成和液相合成。作为固相合成，例如，将对应于待合成肽的C末端的氨基酸结合至不溶于有机溶剂的支持物上，并通过两个交替重复的反应，一个反应中使其氨基和侧链官能团被适当保护基团所保护的氨基酸从C末端至N末端一个接一个地按顺序缩合，一个反应中结合至树脂的氨基酸或者所述肽的氨基基团的保护基团被释放，肽链从而以这种方式进行延伸。根据所使用的保护基团类型，固相合成方法主要按照tBoc方法和Fmoc方法分类。通常使用的保护基团包括：用于氨基基团的tBoc(叔丁氧羰基)、Cl-Z(2-氯苄氧羰基)、Br-Z(2-溴苄氧羰基)、Bzl(苯甲基)、Fmoc(9-芴基甲氧羰基)、Mbh(4，4’-二甲氧基二苯甲基)、Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)、Trt(三苯甲基)、Tos(甲苯磺酰基)、Z(苄氧羰基)和Clz-Bzl(2，6-二氯苯甲基)；用于胍基基团的NO2(硝基)和Pmc(2，2，5，7，8-五甲基色烷-6-磺酰基)；以及用于羟基的tBu(叔丁
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基)。在合成所期望的蛋白之后，对其进行脱保护反应，并将其从固体支持物上切割下来。这种肽切割反应在Boc方法中是利用氟化氢或三氟甲烷磺酸来实施，而在Fmoc方法中则是利用TFA。
[0061] 或者，可利用重组技术来合成肽。在这种情况下，一种核酸和/或基因构建体，其包含如下序列或由如下序列组成的：编码本发明的肽的核苷酸序列、具有与上述序列之一互补的核苷酸序列的多聚核苷酸以及在严紧条件下与所述多聚核苷酸杂交的序列。[0062] 本发明进一步涉及由如下序列组成或包含如下序列的基因构建体：如本文所定义的多聚核苷酸以及允许本发明的肽在宿主细胞中表达(例如转录和翻译)的调控序列(例如合适的启动子、增强子、终止子等)。[0063] 因此，在另一个方面中，本发明涉及表达(或者在合适的条件下能够表达)本发明的肽和/或含有本发明的多聚核苷酸或本发明的基因构建体的宿主或宿主细胞。[0064] 生产肽的方法可任选包括纯化所述肽、化学修饰所述肽和/或将所述肽配制成药物组合物的步骤。
[0065] 嵌合构建体：
[0066] 肽X1-KKKIK-ψ-EI-X2-X3(I)(SEQ ID NO：1)在本发明中可用作细胞穿膜肽(CPP)。
[0067]
因此本发明提供了包含所述肽的载体，所述肽作为细胞跨膜肽与目标分子相偶
联。
目标分子可以与一个或数个此类CPP相偶联。[0069] 目标分子可以是任意治疗剂，包括细胞毒性剂(优选促细胞凋亡肽)、抗病毒剂或抗细菌或抗寄生虫剂。
[0070] 在优选的实施方式中，可以制备包含所述肽的嵌合肽构建体，所述肽作为细胞穿膜肽与促细胞凋亡肽融合。[0071] 优选地，促细胞凋亡肽与穿膜肽的C端融合。[0072] 促细胞凋亡肽可以是任意的目标促细胞凋亡肽。[0073] 嵌合肽构建体优选可具有23至70个氨基酸之间，优选23至40个氨基酸之间的长度。
[0074] 在优选的实施方式中，促细胞凋亡肽是半胱天冬酶-9蛋白的片段。[0075] 根据一个实施方式，可用于本发明的嵌合肽构建体包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成：
[0076] Y-X4a-ETLD-X4b-I-X5-EQWA-X6-S-X7(SEQ ID NO：3)，[0077] 其中
[0078] X4a为缬氨酸或异亮氨酸；[0079] X4b为天冬氨酸或甘氨酸；[0080] X5为苯丙氨酸或亮氨酸；[0081] X6为精氨酸或组氨酸；[0082] X7为空缺或谷氨酰胺，或谷氨酰胺-天冬酰胺，或谷氨酰胺-天冬酰胺-亮氨酸；或
[0068]
经一种或多种化学修饰衍生自所述促细胞凋亡肽的抗蛋白水解肽，或经一个或多
个保守性替换衍生自SEQ ID NO：3的基本上同源的肽。
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这种抗蛋白水解或同源肽在体外和/或体内诱导细胞凋亡。确定一种分子(例如肽)是否诱导细胞凋亡的分析方法是本领域所熟知的，包括例如将细胞与候选肽温育并确定所述候选肽是否诱导了细胞凋亡，例如通过膜联蛋白(Annexin)V和PI标记细胞并将膜联蛋白(Annexin)V+和PI-的那些细胞识别为凋亡细胞。[0085] 在优选的实施方式中，
[0086]
X4a为缬氨酸；
[0087] X4b为天冬氨酸；[0088] X5为苯丙氨酸；[0089] 以及X6为组氨酸。
[0090] 在一个具体的实施方式中，嵌合肽构建体是：
[0091] VKKKKIKAEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL(SEQ ID NO：4)，在本文中也命名为Mut3-DPT-C9h。
[0092] 在另一个具体的实施方式中，嵌合肽构建体是：[0093] VKKKKIKAEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL(SEQ ID NO：5)。[0094] 在另一个具体的实施方式中，嵌合肽构建体是：[0095] VKKKKIKKEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL(SEQ ID NO：12)，在本文中也命名为Mut1-DPT-C9h。
[0096] 在另一个具体的实施方式中，嵌合肽构建体是：[0097] VKKKKIKKEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL(SEQ ID NO：13)。[0098] 在一个具体的实施方式中，嵌合肽构建体是：
[0099] VKKKKIKNEIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL(SEQ ID NO：14)，在本文中也命名为Mut2-DPT-C9h。
[0100] 仍然在另一个具体的实施方式中，嵌合肽构建体是：[0101] VKKKKIKNEIKI-YIETLDDILEQWARSEDL(SEQ ID NO：15)。[0102] 仍然在另一个实施方式中，促细胞凋亡肽是包含如下序列或由如下序列组成的PP2Ah肽：
[0103] a)氨基酸序列DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO：8)；[0104] b)与SEQ ID NO：8基本上同源、优选与SEQ ID NO：8至少80％的同一性的诱导细胞凋亡的氨基酸序列，；或
[0105]
c)诱导细胞凋亡且经一个或多个化学修饰衍生自a)或b)中所定义的肽的抗蛋白
水解肽。
在优选的实施方式中，促细胞凋亡肽包含序列DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO：9)或由序列DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO：9)组成。[0107] 在一个具体的实施方式中，嵌合肽构建体为
[0108] VKKKKIKAEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO：16)。[0109] 在另一个具体的实施方式中，嵌合肽构建体为
[0110] VKKKKIKKEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO：17)。[0111] 仍然在另一个具体的实施方式中，嵌合肽构建体为[0112] VKKKKIKNEIKI-DTLDHIRALDRLQEVPHEGP(SEQ ID NO：I8)。
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针对蛋白水解的进一步保护：[0114] 任选地，可保护本文中所述肽的N-和C-末端不受蛋白水解。例如，N-末端可以以酰基的形式，和/或C-末端可以以酰氨基的形式。还设想了对肽进行内部修饰以对蛋白水解形成抗性，例如其中至少用(CH2NH)还原键、(NHCO)逆反键(retro-inverso bond)、(CH2-O)亚甲基-氧键、(CH2-S)硫代亚甲基键、(CH2CH2)卡巴键(carba bond)、(CO-CH2)羰基亚甲基键(cetomethylene bond)、(CHOH-CH2)羟乙基键、(N-N)键、E-alcene键或-CH＝CH键对-CONH-肽键进行修饰和取代。[0115] 例如，可通过乙酰化、酰化、酰胺化、交联、环化、形成二硫键、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚定、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、磷酸化等对肽进行修饰。
[0116] 本发明的肽可由D构型的氨基酸组成，其能使肽对蛋白水解具有抗性。可通过分子间交联稳定这些肽，例如根据Walensky等，2004中所描述的所谓“订书钉(staple)”技术，用烯族侧链，优选C3-C8烯基链，优选戊烯-2-基链对至少两个氨基酸残基进行修饰，随后对链进行化学交联。例如，在位置i和i+4至i+7处的氨基酸可被显示出活性烯属残基的非天然氨基酸残基取代。所有这些抗蛋白水解的化学修饰肽都包括在本发明中。
[0117]
在本发明的另一个方面中，肽可通过其C-末端残基或赖氨酸残基与聚乙二醇
(PEG)分子特别是1500或4000MW的PEG共价结合，以减少其在尿中的清除及所使用的治疗剂量，并且延长其在血浆中的半衰期。仍然在另一个实施方式中，通过将肽包括进形成微球的用于药物递送系统的生物可降解和生物相容性聚合材料中，来延长肽的半衰期。例如，聚合物和共聚物是聚(D，L-丙交脂-共-乙交脂)(PLGA)(如US2007/0184015，SoonKap Hahn等的阐述)。[0118] 核酸
[0119] 本发明还涉及包含或由编码本发明肽的核苷酸序列组成的多聚核苷酸。[0120] 本发明进一步涉及由如下序列组成或包含如下序列的基因构建体：如本文所定义的多聚核苷酸以及允许本发明的肽在宿主细胞中表达(例如转录和翻译)的调控序列(例如合适的启动子、增强子、终止子等)。
[0121] 本发明的基因构建体可以是DNA或RNA，并优选为双链DNA。本发明的基因构建体还可以是适合于转化预期宿主细胞或宿主有机体的形式、适合于整合进预期宿主细胞的基因组DNA的形式或者适合于在预期宿主有机体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传构建体可以是载体形式，例如质粒、粘粒、YAC、病毒载体或转座子。特别地，载体可以是表达载体，即能够提供体外和/或体内表达(例如在合适的宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)的载体。
[0122] 在优选但是非限制性的方面中，本发明的基因构建体包含i)至少一条本发明的核酸；其可操作性地连接至ii)一个或多个调控元件，例如启动子和任选地合适的终止子；以及任选地还包含iii)一个或多个其他的基因构建体元件，例如3’或5’-UTR序列、前导序列、选择标志物、表达标志物/报告基因和/或可利于或提高转化或整合(效率)的元件。在具体的实施方式中，编码本发明的细胞穿膜肽的核酸与编码目标肽或蛋白的核酸相偶联或融合。目标肽可以是如本文中所述的促细胞凋亡肽。更普遍的是，目标肽或蛋白可以是待表达的任意肽或蛋白，例如治疗性肽或多肽，以及如果需要，可以是任意的抗原
[0123]
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性或免疫原性肽。
[0124] 核酸可特别地由病毒载体例如腺病毒或慢病毒携带，用于与细胞穿膜肽偶联的目标肽或蛋白在离体或体内的感染和表达。[0125] 促细胞凋亡活性：
[0126] 如本文中所定义的嵌合肽或编码所述肽的核酸，可用于在体外或体内抑制细胞增殖。
[0127] 它们都是有用的治疗剂，特别是用于治疗过度增生性疾病。[0128] 因此描述了在有需要的患者中治疗过度增生性疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用嵌合肽构建体或编码所述构建体的核酸。
[0129] 肽(或编码所述肽的核酸)可用于治疗优选人类患者中的肿瘤，特别是癌性肿瘤。[0130] 过度增生性病症可以是癌症，例如血液性癌症，特别是急性粒细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞、皮肤T细胞淋巴瘤，或者非血液性癌症，例如脑癌、表皮样癌(特别是肺、乳腺、卵巢)、头颈癌(鳞状细胞)、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、头癌、颈癌、肾癌、前列腺癌、结肠直肠癌、食道癌或甲状腺癌，以及黑色素瘤。不同类型的癌症包括但不限于：纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因(Ewing's)瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、淋巴瘤、白血病、鳞状细胞瘤、基底细胞瘤、腺瘤、汗腺瘤、皮脂腺瘤、乳头状瘤、乳头状腺瘤、囊腺瘤、骨髓瘤、支气管瘤、肾脏细胞癌、肝细胞瘤、胆管瘤、绒膜瘤、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆斯(Wilm's)瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤以及成视网膜细胞瘤、葡萄膜黑色素瘤和乳腺癌。[0132] 更具体地，本发明所描述的肽(或编码所述肽的核酸)可用于治疗表现出PP1和/或PP2A失调或表现出抗细胞凋亡蛋白Bcl-2过表达的癌症，Bcl-2是与PP1和PP2A相互作用并受其调控的细胞凋亡调控物。
[0133] 已经发现人bcl-2基因在具有t(14；18)染色体易位的所有淋巴瘤中都有高水平的表达，包括大部分滤泡性B细胞淋巴瘤以及很多大细胞非霍奇金氏淋巴瘤。还发现bcl-2基因在不具有t(14；18)染色体易位的白血病中有高水平的表达，包括前体B细胞型的淋巴细胞白血病，成神经细胞瘤，鼻咽癌，以及前列腺、乳腺和结肠的很多腺癌。尤其是在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中发现了bcl-2的过表达(Deng等，2009；Pickett等，2004)。[0134] 因此，在优选的实施方式中，癌性肿瘤是淋巴瘤、尤其是白血病，例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)。[0135] 此外，嵌合肽(或编码所述肽的核酸)可用于治疗转移癌。[0136] 根据另一个实施方式，过度增生性病症可以是非癌性增生性病症，例如皮肤良性增生(例如牛皮癣)或前列腺良性增生(例如良性前列腺肥大(BPH))、类风湿性关节炎、炎性肠病、骨性关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化或口腔毛状白斑。
[0131] [0137]
本文所描述的嵌合肽(或编码所述肽的核酸)也可用于治疗寄生虫疾病。
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具体地，嵌合肽(或编码所述肽的核酸)可具有将受试者体内的寄生虫载量降低至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的能力。
[0139] 本发明还提供了在有需要的患者中治疗寄生虫疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用嵌合肽或编码所述嵌合肽的核酸。[0140] 优选地，寄生虫疾病是由属于椎体虫属(Trypasonoma)、泰勒尔梨浆虫属(Theileria)或疟原虫属(Plasmodium)物种的寄生虫所造成的。[0141] 由椎体虫属引起的寄生虫病可以是人的昏睡病，人的查加斯(Chagas)病，反刍牲畜、马和猪的那加那(Nagana)病，鸟类的椎体虫病，马和其他马科动物的媾疫或covering病。
[0142] 由泰勒尔梨浆虫属引起的寄生虫病可以是热带thleriosis、地中海热(Mediterranean Coast Fever)、东海岸热(East Coast Fever)或马或绵羊梨形虫病。[0143] 由疟原虫属引起的寄生虫病可以是疟疾。[0144] 药物组合物：[0145] 本发明的载体，特别是嵌合肽(或编码所述肽的核酸)可以通过任意便利的途径进行施用，包括静脉、口服、经皮、皮下、粘膜、肌内、肺内、鼻内、肠胃外、直肠、阴道和局部施用。特别优选鼻内途径。
有利地，还设想了肿瘤内施用。
[0147] 治疗剂与药学上可接受的载体一起配制。
[0148] 药物组合物还可包括或与任意其他的活性物质组合，具体例如抗癌剂，如使用DNA复制抑制剂或使用如生物碱的抗有丝分裂剂(anti-mitogenic agent)的常规细胞毒性化学疗法，所述DNA复制抑制剂如DNA结合剂特别是烷化或嵌入(intercalating)药物，抗代谢物试剂例如DNA聚合酶抑制剂，或拓扑异构酶I或II抑制剂。在进一步的实施方式中，本发明的载体，特别是嵌合肽(或编码所述肽的核酸)可与蛋白酶(激酶、芳香酶、ATP酶)抑制剂、单克隆抗体或激素或激素类似物组合。[0149] 在优选的实施方式中，可通过电穿孔来施用治疗剂。由于施加了一定的短且强的电场穿过细胞膜、细胞或组织，电穿孔，也被称为电通透或电注射，是细胞膜的透化过程。通常电穿孔由如下步骤组成：注射化合物，优选通过肌肉内或皮内途径，随后利用与发动机连接的电极施加一系列的电脉冲。在注射区域施加电场的条件是本领域技术人员所熟知的，并具体描述于美国专利5468223中。本领域技术人员将能够根据每种情况调整这些条件。电场可以是范围为1-5000V/cm的高强度电场的50-200微秒脉冲，其频率为0.1至1000赫兹之间。通常施加一系列频率为1赫兹的、8个1000-1500V/cm的100微秒脉冲。[0150] 治疗剂，例如嵌合肽，与药学上可接受的载体一起配制。
[0151] 含有溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制备在本领域中是已知的，无需基于配方进行限制。通常可将此类组合物制备成可注射的液体溶液或悬浮液；然而，也可以制备成适合于在使用前形成液态形式的溶液或悬浮液的固体形式。也可对制备品进行乳化。具体地，药物组合物可被配制成固体剂量形式，例如囊剂、片剂、丸剂、粉末、糖衣丸剂或粒剂。
[0146]
介质的选择以及介质中活性物质的含量一般依据活性化合物的溶解性和化学特
性、施用的具体方式以及药学实践中所遵守的规定来确定。例如，可以使用以下试剂来制备
[0152]
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片剂：赋形剂，如乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙；崩解剂，如淀粉、褐藻酸；某些与润滑剂如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石组合的复合硅酸盐。为了制备囊剂，使用乳糖和高分子量的聚乙二醇是有利的。当使用水性悬浮液时，其可包含乳化剂或促进悬浮的制剂。也可使用稀释剂，如蔗糖、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇和氯仿或其混合物。
[0153] 制备过程可以包括将所期望的分子与使产品受控地或持续地释放的试剂一起配制，例如可注射微球、生物溶蚀性颗粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚羟基乙酸)、珠子或脂质体。
[0154] 剂量由本领域技术人员选择，以实现促细胞凋亡的效果，其取决于施用途径以及所使用的剂型。以单剂量或分次剂量施用给受试者的嵌合肽的每日总剂量的量为例如每日约0.001至约100mg/kg体重，优选为0.01至10mg/kg/天。单位剂量组合物可包含其这种约数的量，以能够用于组成每日剂量。然而，将要理解的是，用于任何特定患者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间和途径、吸收和排泄速率、与其他药物的联合使用以及在治疗的特定疾病的严重程度。[0155] 本发明进一步的方面和优点将在下面的实验部分进行披露，其应当被看作是说明性的而非限制本发明的范围。
附图说明：
[0156] 图1是显示用Proteominer分级分离和Maldi-Tof分析的突变肽稳定性的图示。呈现了每种选测物(pick)相对于其自身对照的强度比。R残基被突变为K(Mut1-DPT-C9h)、N(Mut2-DPT-C9h)或A(Mut3-DPT-C9h)。圆形：对照DPT-C9h肽(SEQ ID NO：6)，方形：Mut1-DPT-C9h，三角形：Mut2-DPT-C9h，菱形：Mut3-DPT-C9h。
[0157] 图2显示了通过乳腺癌细胞系HBCx-12A的annexin-V-FITC染色进行的细胞凋亡分析。乳腺癌细胞系HBCx-12A用100μM对照和突变肽处理了24小时。
[0158] 图3显示了Cy5DPT-c9h或Cy5Mut3DPT-C9h的生物分布。在小鼠肩胛间移植管腔乳腺癌异种移植物HBCx-3。它们以5mg/kg的剂量接受用Cy5标记的DPT-C9h或Mut3DPT-C9h的一次腹腔内注射。对照小鼠接受对照赋形剂(5％葡萄糖)。在Oh(注射前)至注射后的168h之间对小鼠进行成像。通过利用Living成像软件对肿瘤荧光进行计算并标准化。实施例：
实施例1：不可降解的突变DPT-C9h穿膜肽的设计和表征
[0160] 1.1材料和方法[0161] 肽合成和序列
[0162] 用固相方法和标准Fmoc化学法在全自动多重肽合成仪上合成肽。通过反向HPLC和氨基酸分析来确定肽的纯度和组成。[0163] 分析肽在人血清中的稳定性[0164] 如先前所描述，通过Proteominer和Maldi-Tof对肽降解进行分析。[0165] 1.2结果[0166] DPT-C9h为VKKKKIKREIKI-YVETLDDIFEQWAHSEDL(SEQ ID NO：6)，
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R残基被突变为K(Mut1-DPT-C9h)、N(Mut2-DPT-C9h)或A(Mut3-DPT-C9h)。[0168] 图1显示在与人血清接触24小时后，Mut3-DPC-C9h未被降解。此外，相比对照肽(DPT-C9h)，其他突变体显示出更高的稳定性。[0169] 实施例2：突变DPT-C9h对于细胞凋亡的影响[0170] 2.1材料和方法细胞
[0172] 已经从原发性人癌症异种移植物中分离得到人乳腺癌HBCx-12A细胞系，并在补充有10％FCS的RPMI培养基中进行培养。
[0173] 通过annexin-V-FITC染色检测细胞凋亡[0174] 使用Annexin-V(-FITC，来自于BD biosciences)根据制造商所描述检测凋亡的细胞。简言之，用1×结合缓冲液洗涤细胞，离心，接着将细胞重悬于200μl含有Annexin V-FITC(0.1μg/ml)和PI(0.5μg/ml)的1×结合缓冲液中。在黑暗中于室温下温育10分钟之后，用流式细胞仪分析细胞。用Cellquest Pro软件对由FACSCalibur(BD biosciences)获得的结果进行分析。[0175] 2.2结果[0176] 本发明人随后分析了突变肽是否保留了诱导细胞凋亡的能力。用100μM的对照肽和突变肽处理乳腺癌细胞系HBCx-12A24小时。通过annexin-V-FITC染色分析细胞凋亡。如图2中所示，所分析的肽诱导了类似水平的细胞凋亡。当使用细胞系HBC-x3和HBCx-17时也观察到了相同的结果。[0177] 实施例3：Mut3DPT-C9h在肿瘤中的生物分布[0178] 3.1材料和方法[0179] 肽合成和序列
[0180] 如上所述合成肽(DPT-C9h和Mut3DPT-C9h)。在肽合成的过程中加入荧光染料Cy5。
[0181] 荧光测定法
[0182] 用肽Cy5DPT-C9h或Mut3DPT-C9h(5mg/kg)通过IP(腹腔内)注射小鼠，然后在注射后的不同时间进行分析。
[0183] 使用IVIS成像系统(IVIS100，Caliper Life Sciences，USA)进行荧光成像。在分析时麻醉小鼠。图像采集时间为1s至10s，这取决于荧光信号。利用软件Living ImageV.2.50(Caliper Life Sciences)进行分析。
[0171]
3.2结果[0185] Mut3DPT-C9h和DPT-C9h在乳腺癌异种移植物模型中的生物分布。
[0186] 本发明人对于分析和比较两种肽的生物分布感兴趣。图3显示了Cy5DPT-C9h和Cy5Mut3DPT-C9h在乳腺癌异种移植物模型中的生物分布。对小鼠进行IP(腹腔内)注射，并在注射后的不同时间分析生物分布。[0187] 图3显示，在IP注射后6h，本发明人均能够在肿瘤中检测到这两种肽。Cy5Mut3DPT-C9h检测的最大峰值在注射后23h检测到，该时间后荧光强度略微降低。最终，在注射后168h检测到了相当水平的Cy5Mut3DPT-C9h。Cy5DPT-C9h荧光的最高水平是在注射后6小时检测到的，在这段时间之后略微降低。在治疗的168小时之后检测到了低水平
[0184]
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的Cy5DPT-c9h。[0188] 总地来讲，这些结果显示Cy5标记的DPT-C9h和Cy5标记的Mut3DPT-C9h到达了肿瘤。更为重要的是，Cy5标记的Mut3DPT-C9h显示比原始肽DPT-C9h更加稳定。
[0189] 突变肽Mut3DPT-C9h显示其在肿瘤中的生物分布比原始肽(DPT-C9h)更加持久，因为我们能够检测到Cy5荧光染料的荧光时间比DPT-C9h的荧光更长。
[0190] 这种新特性将允许减少所注射肽的剂量以及施用疗程。概括来说，由于不会被血清蛋白酶所降解，新的突变体与对照肽相比具有明显的新优势并且具有新的特征。[0191] 参考文献[0192] Deng X，Gao F和W.Stratford May.Dephosphorylation and up-regulation of Bc12-p53 binding Protein phosphatase 2A inactivates Bcl-2′s antiapoptotic function by dephosphorylation and up-regulation of Bc12-p53 binding.Blood.2009年1月8日；113(2)：422-8.[0193] -Guergnon，F.Dessauge，V.Dominguez，J.Viallet，X.Cayla，A.Rebollo，V.Yuste，S.Susin，PE.Bost和A.Garcia.Use of penetrating peptides interacting with PP1/PP2A proteins as a basis for a new Drug Phosphatase Technology.Mol.Pharmacol.(2006)69：1115-1124.-Lehninger，(1975)Biochemistry，Second Edition，Worth Publishers，Inc.New-York：NY.，pp.71-77.[0195] -Pitton，C.，Rebollo，A.，Van Snick，J.，Theze，J.和Garcia，A.(1993)High affinity and intermediate affinity forms of the human IL-2 receptor expressed in an IL-9-dependent murine T cell line deliver proliferative signals via differences in their transduction pathways.Cytokine，5，362-371.
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