110ChineseoJurnalfopharn,aeo口lg,andoTxciol帽,1994May;s(2):l一。一l一3烟碱受体在非洲爪蟾卵母细胞的表达及特征陈厚昌’oS(eeergePHEsstionfoBioeir即hemsMoelcualrandeC口gJlBiolCornellUniversi妙Ne。OYrk14853)摘要官烟受体(N分别给非洲爪蟾印毋细胞微量注封电瑶电器Z减型胆碱受体(N一ChRz一试剂盒Prome二鸟葺三磷酸(GPPPG)和重蒸酚均为公司产品;)和大鼠脑烟碱型胆碱一ga;氯仿(色谱纯)和无水乙醇为BoeChR)的mRNA表达出相应的NChRFisher公司产品寡聚脱氧胸普纤维素为hringer采用全细胞和部分细胞灌流法测定不同浓度氛甲醚胆Z碱引起的N一ChR产生的膜im公司产品;Mannhe电流以最小反应模型方所有用于mhRNAgma公司产品其余试剂均为Si实验的玻璃器皿均经250℃烤601%程拟合两法所得量反应曲线非常接近LI;小l值分0528和0491mmolI值分别为K以上非玻璃器皿和用于配制溶液的水均以earbona焦另J为3861和碳酸二乙醋(diethy一pyroh以上tenEPC)处理63981采用全细胞灌流法测得不同浓度氛甲酞胆碱引l一而后高压灭菌NZ一chR起的表达N曲线ChR产生的膜电流拟合所得的量反应电鳃5〔的mRNA的制备lh参考文献改为ZhZ较之相应的N一ChR曲线明显左移药和。l值6〕方法并将转录反应时间由聚分另J为0140mmolL1和3125合酶由一次加人改为分2次加人(即先加人一半lh反应后再加入另一半)分别以含电鳃:NZ一ChR四种亚关键词有爪蟾蛤;卵母细胞;受体胆碱能;塞因基(mo刀L’下占)全长eDRNANA的pSP64TRNA为模板通表达;动力学非洲爪蟾卵母细胞(Xeno过体外转录合成ml获得的m溶解于01Kel溶液中配成约059L,置一50℃冰尸uslaevslooeyte)已被冻保存备用silcver广泛应用于表达各种受体蛋白和离子通道蛋白’〕〔为1大鼠脑manN厂chR的mRNA制备根据改良二;研究受体与离子通道的特性和亚基组成等提供了重要手段mm)7〕〔法将已转化了该受体的TD;:和刀正基然而由于卵母细胞体积大(直径约为DNA(分别重组人酵母表达载体p6MAC51和以通常的全细胞灌流方法给药ace最先与药物接象rYEP351中)的酵母(已证明此酵母能转录功能触产生反应的受体与最后者之间的时间差距很大烟碱型胆碱受体(nieotinieN一chReholinetyl’〕〔reeepto。;::;:和刀亚基mRNA及翻译出和刀亚基蛋白性待另文发表)接种于含002%尿啼咤和0002%组氨)这样一些快速脱敏的受体对分析受体酸的至SD(synthetiedex=trose)培养液中30℃培养的特征是否会有影响本文企图用部分细胞灌流法给A60mn住6一08离心收集沉淀2以原体积1/5药以尽量缩短给药表面各部分接触药物的时间差的mL1DEPC处理水洗涤沉淀l/o距N来测定卵母细胞表达的电鳃(oroTPd)电器官eln加原体积Na100的RI0次沉淀置一80℃冻结3NA提取液(015molZ一ChR的某些化学动力学特性并与全细胞灌流法CIsmmlLEnTA5%505sommol者进行比较大鼠脑N等与NZ一l一以评价两种方法之间的差异的结构组成现以证明L’TrispH7)5和等体积酚一氯仿混合液1/混合后置尽mChR特异性激动剂和拮抗剂‘〕室温smm珠加人约4min3体积的直径054坡璃chR有明显的差异以但很少见有关两种振荡混合离心收集水相再以酚氯仿混受体动力学特性的比较表达的N较l一和NZ一ChR本文企图通过测定卵母细胞的某些化学动力学参数进行比一合液反复抽提2一3次乙醇沉淀RNARNA以寡8oy(A)聚脱氧胸普纤维素亲和层析法〔〕分离得plRNA159为阐明两种不同亚型的NChR的特征提供点滴后者溶解于L’01molL’KI溶液中配成约C实验依据供注射用卵母细胞的制备及注射9〕的方法参考文献〔20一50材料与方法非洲爪蟾购自1993一01一11制备卵母细胞;每个细胞注射01molnL的mRNA溶AnnAbr。:公司RNA体外转录液对照组注射等量的9L’KIC注射后的卵母细胞置于含50收稿1993一08一14L’链霉素10kuL’青霉溶接受厂州素51051506%马血清l5mmo2L’丙酮酸钠的B盯th现在第一军医大学药理教研室液中置16一18℃培养3一10d每天换液一次中国药理学与毒理学杂志1994年5月;8(2)w。〕〔’111表达受体的检测Au参考smikaa的方法受体摩尔数影响爪为测得的电流幅度值(厩)20表示开氨甲酞以及本室建立的全细胞和部分细胞灌流法以n放通道形成的分数所有数据处理不考虑脱敏现象的oxdmamp一ZA双微ts电极电压电流钳位仪(Axonl^均经正常化处理1l即以smmo100nL,struenIne)测定不同浓度氨甲酸胆碱引起的卵胆碱引起的最大电流幅度为mmolA其它浓度所致的母细胞跨膜内向电流流时膜电位固定于一40一一70mV最大电流幅度以此换算成相对幅度L同时均假定5但同一细胞各次测定均固定于同一膜电位卵母细胞置于灌流皿底中央n全细胞灌’氨甲酞胆碱引起的通道开放可能性(PO)M一以含1召molL’为057即编R13nA爪RM值的大小对拟合氨的阿托品的Riger溶液通过连接于恒流泵的流人和流2mm)甲酞胆碱与I^关系曲线影响甚微出管连续灌流流出管(内径卵母细胞约Zmm正对流出管管口管口位于皿底距召m通过一底部有2个100料m)小孔的从图1结果与讨论可见不锈钢U型管(内径200给药U型管两小孔以全细胞和部分细胞灌流法给被注卵母细胞位于小孔与流出管管口之间U型管两端接胶管连接恒流泵使流出端流量>流入端不给药时小孔无药液溢出当给药时通Z射电鳃N一ChR的mRNA后的卵母细胞灌流氨甲酞胆碱均产生明显的跨膜内向电流表明有大量功能性N一ChR的表达n以部分细胞灌流法产生的内向电流速过电磁阀阻断流出端胞B迫使药液从小孔流出而灌流细度较之全细胞灌流法快(各组一13)以部分细胞和全细胞灌流法Z一ChR而后从连续灌流管的流出管排去分别给注射电鳃N的mRNA部分细胞灌流时两半灌流皿以一塑料薄片隔为mA和mm在薄片中部距底部约3ml小孔卵母细胞置于小孔A俱!处钻一直径03以Ringer溶液连B续灌流从A侧流人通过分隔薄片顶部流入侧从B侧流走A侧液面高于B侧约Zmm以液体静压将卵母细胞紧贴小孔使约有10%左右的卵母细胞B表面积暴露于内B侧溶液中双微电极在A侧插人细胞供检测膜电流B于侧设一底部有一个汽径23mm)mm的小孔的U型管(内径给药小孔正对暴露于侧的细胞表面相距约smm其余给药方V、法同全细胞灌流法此种灌流可大大缩短参与反应各己部位接触药物的时间差N一ChR与配基结合导致开放通道数据处理的形成:0s以下面模式LrZ,’〕表示ALLA+AK——ALK1中一一A一L表示活化型受体表示配基(乙酿胆碱和AL:氨甲酞胆碱或其它激动剂)AL表示受体一配基K复合物丽2表示形成受体开放通道’体解离常数小为通道开放平衡常数、为配基一受(I,M*M,R万M1一1):Z’/’一。,/2、。/2、1L〕〔·(!)人=I2M(AL)2。(2)+俪)。一。[L(,。)+2、L。+,、。{](3)Fig一eBothtrae一…earbaes……Tm()neeho“eitedmmy一一e“oeembraneurrents(刀根据最小反应模型l)求得。(’2〔”〕进行数据处理根据方程werebtainedinthesameooerytein声eted7dPreZ一和KI根据方程(3)拟合出氨2)和(iouslywitheeo,Toodnleotiniereceptoo(NChR)mRNAbywith甲酞胆碱浓度与人关系曲线上述方程中爪表示1wholellflw(A)anadtpartancellfl一w(B)5mmolmof开放受体通道产生的膜电流RM代表细胞表面L1earbamylcho一ine25℃d6omV112ChineseoJurnalfol)pharmaeogolyandoTxieol少go]9942May;8(l的卵母细胞灌流smmoL,氨甲酞胆碱和19士测得平均均非常接近h一flochR尤l值与wa一ker〔”〕等用淬流内向电流上升时间(由出现内向电流开始至达最大电流时间)分别为027士q(enuc)技术测得的重组于人工膜中的电鳃w.4mmo0lL:0245075前者NZ一的(凡=’)接近表明两种灌流尸<0001明显短于后者()反映了部分细胞灌流法激动(注射法所得的上述动力学参数有一定的可靠性而全细胞剂到达各反应部位受体所需的时间较之全细胞灌流法灌流法技术上却简单得多基于上述结论明显缩短L所有对照组细胞01mol我们采用全细胞灌流法测定了卵,一’Kl)对氨甲酞胆碱均无反应c母细胞表达的大鼠NZ一以全细胞和部分细胞灌流法给注射电鳃NChR的mRNA的卵母细胞灌流不同浓度的氨甲酞胆碱n系曲线l,得直线(图2)并分别获得K和。值(表1)’50mmloL氨甲酞胆碱引起明显的抑制效应ChR的量反应关回归由于故该ZA获得的最大内向电流(各点~6下同)根据方程组数据未参与拟合量反应曲线和直线回归可见N,一从图Z一2(拟合得的量反应曲线以及根据方程l’3)回归得的直线(图2()并求得的K和。值(表)和(3)大鼠N厂ChR的量反应曲线较之NchR者明显左移ChR前者的Kl值亦较后者小反映了对氮甲酞胆碱较NZ一ChR更为敏感eonstanTab1EquilibriumtsobtainedfromneathelirntofthedatainFigZBnstanCoK哎、三lNtZ一ChRP04913891N一ChR认WWo(mmlL)05283吕61014《)巾3125W:ewholeellflow:P:Partcellflow参考文献1SueontchTPTheuseofXenoP“‘ooeytesroprobesleynaP一mmessunieationITNS198811(6):250一256e2H19【Cbmhy一一GPUdgnsaonkarJBProeChemicalkinusntiemeasurements」(mmlL)oftraiquemembraneetylessesignnraPidreactlonsteehns:aceholinereeePtorARevBPhyBoP从sChe阴一!\\“了了198716:507一534R3AnandCJonroyWlGnSchoePfeaeeretyleRWehi[ingreeenPLindstromexNeuronaicotinicoocholinaPtorspressedyineXnPutuyteJshapetalnerlequarternarstrucreBiol‘he尹1991266(17):11192一111984C【BertrandDoBallivetneuronaMlnusRunggerDtyAetaton比ndrbmylhl}(kLm一)bloekingreeonsfdieotinicoocaeeenlhol一ereeeptotituteinXenPOytesProcNllAads之USA199087(5):1993一1997CotanroFig2Eoseefdeetonfcdareolbamylinoeonnsemtoemcarbebareurrent(IA);o5JaHnsenaKUyxWGPrenClaudo一oTeFourxTDsuFu一taJN(A)Dinlear伴eneeftheanrespomylcholine(B)mllmillorelErnssonifthaeeofbunltsofthreifstsofAIrtsdata(△)d(O):NZ一theresultsobtainedfroTSPedOcal办ieaieotiniectylhol:nereeePto:nooeyteinjctedcwitheePedoorToChRmRNAbywholeceaeeharom多ceseerev行矛aeJBiolCh胡1989lfrfowandpayteollflewrespeetively:(.)resultsobtainedby:一264(25)1502215027omoooeinjetedwithratbrainN一ChRmRNA6SambrookJFritschEFMInan:iatisTToransatonliofsynwhleeellflwthetiemRNAs沉vitroSambrokJtsehFr一EF中国药理学与毒理学杂志1994年52))J;8(113ManiatisTeedseMoleweal:Cloo,矛介了9AaroLa石arlrraI多210SanDiegao:AcademiePressIne1987284一288oMtoanualZnddNYorkCldSPringHborLaboSumikawKMilediRholineholinerlAeaChangeoP一r一ndesensitizarion「eatoryPress1989SJR1881一1884museelaeeetylreeeeausedbybueoexPressionfs751!veomranoseMnsBotsteinDinSaechaF一nkGRReguatolinoTrP亡odaceetylereeePtorsunitsineXmnoPfHIS4一aeIZusiofo”、“es℃reislaeMolooeyresProaonNadseiUSAGPlia198986(l):367一371easure一eClBIOI19822(10):1212一121911Udg一atsikoarJBaHaessChemiealkineticaee8SambroPoly(AeokJFritschEFManTectoSelinofmafentsfmmmancrylholineeareeeelPtorbya)oRNAeu一n:sambrookJFr,Clon廿于tsehEFManiatisTest一reaetionteehniqueProcNarlAdSUS注1987dsMelalr9ALaboraroaryroraManualtoryZndd1284(24):8758一8762NewYork726一729:ColdSvringHborLabPress1989WalkerJWTakeyasuKkinet:esreeePtorMcNoameeMGAetiationand一nacrativationf,tTPedOeal办iea9Marcus一SekurCJHitehcockoMJManPreParation:ofaeeeotylhelinelr、inreeonsritutedmembraneooeyresofmieroin界etionefRNAedDNAInBergg多erBishe阴I198221(22):5384一5389SLKimmlARedsMrhosdoon即脚tEvolExPressionandcharaeteristies刀OP况Sou一ilCHENHSeerto(noofnicotiniecytesogePHESSrnerecePtorsChangGeorfoBioeit即heosMoeleualrandCelBiol口g〕CollUniversir夕Ne、oYrk]4853)oABSTRACTtorPedOorTeeetroPlaxlncotinieirecereceP一、-mmoocolLl。c1or3561and3591werebrained一neoNz一ChR)andratbrainni(nousChR)weresynthesizedinXe尸tinieoocptorN(yteseein,tedwithanoTrPeodNZChRmRNAPeetivelybyAytesafterinejcewhollllfowdPartshifteeoeellfowlrestionwithmRNAconsustranseriPtedinthevirrorfomasmiPldsdo15se一resPonseeurvedtoleftbNutsirnilartowhatPSP64TtainingnofNl一urengthulllfePedOOrTsobtainedorfomaNz一ChRbuiteDNAsorPurifidfr戊;omdyeasttran2刀summooclL1ano,T毋odZ一ChRaoKIof0140df3125wNerebtainedIntheeeerredfewithsratbrainChRanbuwnitaseetedwiytesinjthra一brain!一eChRbywholllDNAMembrandwithorvoeeurrenntheintijetedeueooeyteslowfmlfeasureoltagececalmPteehniqbyParteellwnsand/ewhol!1lfowwithvarousiconeentraKEYnleoWO一eRDSgeneextioofcarbaeeholinemyleXnoPuslan5e、1二ooeyte:reePtorthedoseoresPonsesantotln:oPressi:klneetiearbaemylholinweresarimilK一f0528d0491
