酶制剂工业概况及其应用进展_胡学智

工业微生物

IndustrialMicrobiology

󰀁Vol.33No.4󰀁Dec.2003

酶制剂工业概况及其应用进展

胡学智

(上海市工业微生物研究所,上海200233)

摘󰀁要󰀁󰀁概述了国内外酶制剂工业的生产和市场的情况,并介绍了酶制剂应用的进展,对于我国酶制剂工业的发展也作了展望。关键词:酶制剂;󰀁工业;󰀁应用󰀁󰀁

表1󰀁世界工业用微生物酶制剂市场规模

[1~6]

1󰀁世界酶制剂工业概况

年份销售金额(亿美元)增长%

199310-

1995199612.513.57.2

8.0

19971998*15.4

17.3

199919.2

200022.1

200225.7

󰀁󰀁酶作为商品生产已有100多年历史,早在1833年还没出现酶字之前已有人用酒精沉淀出麦芽淀粉酶,叫Diastase。可使2000倍淀粉液化而用于棉布退浆,微生物酶的生产是1884年日本人Takamine首先开发的,他在美国开Takamine制药厂生产高峰淀粉酶用于棉布退浆和用作消化剂。此后在欧洲、美国和日本先后建立了一些酶制剂工厂,生产动植物酶如胰酶、胃蛋白酶、木瓜酶、麦芽淀粉酶以及真菌细菌淀粉酶等少数品种,其应用范围还限于作为消化剂、制革工业脱灰软化剂和棉布退浆剂等,20世纪50年代前酶制剂工业没什么惊人发展。󰀁󰀁直到60年代随着发酵技术和菌种选育技术的进步,日本酶法生产葡萄糖获得成功,欧洲加酶洗涤剂的流行,70年代酶法生产果葡糖浆又获成功,带动了淀粉深加工工业的兴起,工业酶开始大量需要,使酶制剂工业出现重大转机。工业上使用酶带来了许多的好处,如节约成本,改善品质,减少环境污染等,因而引起人们广泛重视。80年代以后,遗传工程被广泛用于产酶菌种之改良,现在酶制剂工业已成为国民经济的一门重要高科技产业。酶制剂的世界市场于1970年以后迅速增长。从1978年不到2亿美元增加到1990年的5亿美元,1993年已达10亿美元

[6]

14.0712.3410.9815.112.20

󰀁󰀁*有的报道1998年为16亿美元

󰀁󰀁国际上知名的酶制剂企业在上世纪80~90年代有70多家,后来经过兼并改组,不少著名企业,如美国Miles公司,荷兰GistBrocades公司,芬兰FinnSugar公司等从这个行业名单中消失。在酶制剂市场中,丹麦Novozymes公司和美国Genencor国际公司各占世界市场的50%和20%,就近年来酶制剂市场在各应用领域分配来说,据Businesscommunica󰀁tionsCo.估计,1997~2002年的5年中,食品用酶由7.25亿美元增至11.76亿美元,年增长率11.4%,洗涤剂用酶由4.89亿美元增加到8.48亿美元,年增长率13.3%;纺织、制革、毛皮工业用酶将由1.65亿增加到2.58亿,年增长率10.3%;纸浆造纸业用酶由1.0亿增加到1.92亿,年增长率16.2%;化学工业由0.61亿增加到0.96亿,年增长率10.5%,平均年增长率为12.2%。与1985年时食品工业占酶制剂市场62%,洗涤剂用酶占33%,制革纺织业用酶占5%相比,十多年来明显的变化是非食品工业用酶领域迅速扩大,主要是植物纤维加工用酶如纤维素酶,半纤维素酶之在棉布加工,纸浆漂白,废纸脱墨等方面有了较大发展,反映了人们对环保意识的增强。在日本目前食用酶市场规模约为100亿日元,其中1/3为淀粉糖生产用的󰀁󰀁淀粉酶、糖化

,据估计

[4]

1999年为19.2亿美元,2002

年达25亿美元,2008年将达30亿美元[5]。

作者简介:胡学智(1926~),男,教授级高级工程师,本刊编委。

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酶、󰀁󰀁淀粉酶和异构酶,其次是用于肉类软化和制蛋白水解物的蛋白酶,肉类加工用的谷酰胺转移酶以及果汁加工用的纤维素酶与油脂加工和乳制品用的脂肪酶[39]。

表2󰀁1997~2002年世界酶制剂

市场分配金额(亿美元)

产业

食品、饲料业洗涤剂、清洗剂业纺织、制革、毛皮业造纸、纸浆业化学工业总计

19977.254.891.651.000.6115.4

19988.115.531.821.160.6817.3

200211.768.482.581.920.9625.7

平均增长率

11.413.310.316.210.512.2

授予,审批手续比FDA还严,我国酶制剂要向海外发展对此不可不加注意。

2󰀁我国酶制剂工业概况

󰀁󰀁虽然一般认为中国的酶制剂工业诞生于1965年无锡酶制剂厂成立之日,但是早在1960年前国内就有一些制药厂设车间利用酒精沉淀法生产胰酶、胃蛋白酶和麦芽及米曲霉淀粉酶作为医学用消化剂,胰酶还用在制革厂作为软化和脱灰剂。酒精沉淀法提取动物酶的方法至今还在许多生化制药厂采用。就工业用微生物酶来说,1956~1959年上海酒精厂在上海市轻工业研究所与轻工业部食品发酵研究所协作下,用10000升发酵罐深层培养黑曲霉NRRL330生产糖化酶作为酒精生产之糖化剂,这是我国第一个将抗生素发酵的深层培养技术引入我国的发酵工业,是酒精工业的重大革新[7]。在印染行业那时国外已采用酶法退浆,中国还是空白,1958年上海印染二厂在上海市轻工业研究所协作下建3000升发酵罐生产枯草杆菌液体淀粉酶用于棉布退浆[8]。1959年上海市轻工业研究所和上海酒精厂,制革厂合作,采用固体培养法生产栖土曲霉3.374蛋白酶用于皮革脱毛,以革新过去脏、累、污染严重的灰碱脱毛法[9]。蛋白酶还用于照相废胶卷脱胶回收三醋酸纤维片基和蛋白胨生产不过那时还无酶制剂厂之名而已。

󰀁󰀁在这之前国内一些科研院校已进行了大量扎实的基础的工作,如中科院微生物研究所先后分离了不少产淀粉酶、蛋白酶活力高的细霉菌种,无偿提供给国内各相关单位使用。1960年后上海市轻工业研究所、成都生物所、轻工业部食品发酵研究所、华南工学院、江苏轻化厅科研所、轻工业部皮革所以及上海天津等地的皮革厂、上海溶剂厂、上海正广和汽水厂等就细菌淀粉酶、蛋白酶、霉菌糖化酶的生产和应用进行了广泛研究,并建车间自产自用,为了加速发展纺织物酶法退浆工艺,轻工业部向江苏轻化厅科研所下达细菌󰀁󰀁淀粉酶产业化的研究,使用北京纺织研究所从退浆剂中分离的菌种(即BF7658),在完成实验室工作后与无锡制药厂协作进行发酵罐中间试验,1964年通过技术鉴定,并建立无锡酶制剂厂进行生产。1960年因前苏联中止协议,致使保定

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󰀁󰀁目前业已发现的酶有5000种左右,其中已经利用的有150种左右,工业生产的酶约60多种,而大量生产的只有20多种,占已知酶的很小一部分(约0.4%),其中80%为水解酶,而自然界中大量存在的生化反应是氧化还原反应,氧化还原酶的应用有待开发

[2]

。随着遗传工程的普及,现在工业用微生

物酶的80%以上已是用基因改良菌株生产的产品[6],但在饲料用酶,食品工业用酶,据说在欧共体遭到禁用,新日本化学工业也强调是非GMO(Ge󰀁neticModifiedOrganism)产品。在国外,酶制剂是作为食品添加剂的,对其生产所用菌株,工艺过程和产生场地要符合GMP要求(GoodManufacturingPrac󰀁tice),所用菌株要符合FAO/WHO食品添加剂专家委员会JECFA(JointFAO/WHOExpertCommitteeOnFoodAdditives)的评估标准,在美国酶制剂产品要符合GRAS(GeneralRecognizedasSafe)或食品添加剂要求。

󰀁󰀁在美国用来生产食品酶的动物性原料(如胨,牛肉膏等)必须符合肉类检验的各项指标,执行GMP生产。此外近年世界食品市场推行Kosher食品认证制度,即符合犹太教规要求的食品制度,有了Kosher证书,才可进入世界犹太组织的市场。在美国不仅是犹太人,连穆斯林、素食者以及对食物过敏者大多数购食Kosher食品。Kosher食品中不得含有猪、兔、马、蛇、虾、贝类、有翼昆虫和爬虫类的成份。加工Kosher食物的酶同样要求符合Kosher食品的要求,故国外许多食品酶制剂都印有符合Kosher食品的标记,Kosher食品要求专门权威机构

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工󰀁业󰀁微󰀁生󰀁物

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电影胶片厂用于回收废片的蛋白酶车间停建,中科院微生物研究所于1964年筛选出了蛋白酶高产菌枯草杆菌1.398,并同江苏轻化厅研究所合作研究通过鉴定后,由无锡酶制剂厂生产。此后连云港、温州、北京、山东、上海、天津等地酶制剂厂相继建立,到1976年全国已开设酶制剂厂近20家。󰀁󰀁为了促进微生物工业与酶制剂工业的发展,1970年国家科委举办了全国微生物应用展览会,轻工业部于1976年起多次召开酶制剂生产和应用座谈会,并成立了行业协会,指导酶制剂工业的发展。国家科委组织全国有关科研机构大专院校与酶制剂企业三结合大协作,自󰀁六五󰀁以来近二十年来连续进行科研攻关,使我国酶制剂生产技术提高到了一个新的水平,填补了不少行业空白。随着改革开放,外资和国外技术的引进,尤其是国际酶制剂工业巨头Novozymes和Genecor公司等也进入了中国市场独资或合资办厂,带来了国际先进技术和经营理念,使中国酶制剂工业出现了一个崭新局面,酶制剂产品主要品种已达到了上世纪的80~90年代国际水平。全国具有一定规模的酶制剂厂约有50家,分布在国内10多个省市和自治区,其中有20多家企业是产量占全行业80%以上的行业重点企业。全国2002年酶制剂总产量35万吨,酶制剂品种有20多种,应用在食品、饲料、制革、洗涤剂、纺织、酿造、造纸、医药等许多行业,为这些行业的生产带来了巨大的经济效益。例如味精发酵原料采用酶糖化代替酸法糖化,糖化得率提高10%,年产万吨的味精厂,可增产味精400吨[10]。全国味精产量90多万吨,增产效益可想而知。柠檬酸使用高温淀粉酶液化后,产酸转化率比原来提高了4.3%,全国柠檬酸产量有35万吨以上,增产数量也不小。酒精工业使用高温淀粉酶和糖化酶代替曲法生产后,酒精产率提高,现在又使用酸性蛋白酶,提高了酵母对玉米中蛋白质的利用率,醪中酒精浓度提高0.2%以上[12]。全国生产饲料6500万吨,其中10%是加酶饲料,由于酶的添加使饲料效率增加了10%。全国洗衣粉有200万吨,其中1/4已加碱性蛋白酶,加酶洗衣粉洗衣效率提高,用量得以节省,还可减少环境污染。其它如淀粉糖、白酒、啤酒、棉布退浆和整理、毛皮软化、皮革生产无不使用了酶制剂而受益。

󰀁

󰀁󰀁但是由于种种原因,我国酶制剂的生产与应用发展得很不平衡,多年来酶制剂总产量的80%是󰀁󰀁淀粉酶和糖化酶,尤其糖化酶占到60%以上,其次为碱性蛋白酶占16%左右,其它酶约只占5%。从酶的应用来说,淀粉酶之绝大部分是用在白酒、酒精酿造,小部分用于去味精、柠檬酸、淀粉糖等行业,碱性蛋白酶主要用于洗涤剂生产,其它方面的应用比例还很低。

3󰀁酶制剂应用的新进展

3.1󰀁制造功能性低聚糖[10,11,43]

󰀁󰀁功能性低聚糖是一种益生元(prebiotic),也叫双歧因子,是由2~10个单糖分子构成的糖聚合物,这种糖不被哺乳类消化道消化吸收,食后可直达大肠促进大肠中双歧杆菌等益生菌(probiotic)增殖,从而对宿主产生健康效应。例如调整肠道微生物菌群平衡,改善肠道功能,抑制肠道腐败,降低血脂胆固醇,增强机体免疫功能等等。低聚糖可从多糖的酶水解、酶转移反应,或从天然植物中提取,或化学法合成,工业上低聚糖是酶法水解或酶转移法生产的。󰀁󰀁低聚果糖是1983年第一个酶法合成的双歧因子,它是用蔗糖为原料,由黑曲霉等微生物果糖基转移酶或蔗糖酶的转移反应,使在蔗糖分子之果糖残基上接上1~3个果糖所成的蔗果低聚糖,或者由菊粉作为原料,由微生物菊粉酶作有限水解生成的果糖酐型的低聚果糖。以其保健功能显著而受到人们重视,至今已开发出约20种功能性低聚糖,作为健康糖源而在世界各国广泛流行,使用在数百种食品和保健食品生产。这类糖甜度为砂糖30%~60%,热值是蔗糖之40%,食后不升高血糖,也不蛀牙,可代替砂糖每天食3~8g,一周以后便有整肠作用。大多数功能性低聚糖,使用各种酶的糖基转移反应或多糖的有限水解作成。糖基转移反应和水解反应可用下式表示:

Glycosyl-X+H-X󰀁󰀁Glycosyl-X󰀁+H-X󰀁󰀁当受体分子H-X,是水分子时是为水解作用,若受体分子为糖或糖醇时,是为糖基转移反应。一般糖苷酶因底物或糖浓度不同而可发生转移或水解反应。业已大量生产和应用的功能性低聚糖有低聚果糖、低聚乳糖、乳蔗糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、

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低聚甘露糖以及非酶法制备的低聚糖如水苏糖、棉子糖、乳酮糖等。其中低聚木糖是最有效的双歧因子,日摄0.7g即可发挥作用。世界这类低聚糖的产量约10万吨,其中日本约2万多吨(60亿日

低聚糖

低聚果糖低聚木糖低聚乳糖乳果糖低聚异麦芽糖异潘糖低聚甘露糖

蔗糖菊粉木聚糖乳糖蔗糖、乳糖淀粉普鲁兰甘露聚糖

[17,18,19,20]

元)[43],我国也有3万吨之产量。此外还有琼脂低聚糖(agaro󰀁digose),壳低聚糖(chitosanaligose)等具有整肠免疫赋活和抑癌作用的低聚糖,和有特殊生

物学性质的海藻糖无不是用酶法生产的。

表3󰀁各种功能性低聚糖及其所用的酶

原料

菊粉酶(青霉,酵母)木聚糖酶(黑曲霉,细菌)

乳糖基转移酶,乳糖酶(米曲霉,酵母)󰀁󰀁半乳糖苷酶,果糖基转移酶(米曲霉,黑曲霉)󰀁󰀁淀粉酶,󰀁󰀁淀粉酶,真菌󰀁󰀁淀粉酶(米曲霉)

󰀁󰀁葡萄糖苷酶(黑曲霉),普鲁兰酶,糖化型󰀁󰀁淀粉酶(枯草杆菌)放线菌淀粉酶(嗜热放线菌)甘露聚糖酶(黑曲霉)

酶及来源

果糖基转移酶,蔗糖酶(黑曲霉、担子菌)

3.2功能性肽的开发terstain),据称可起到与调控食欲相关的神经传递肽的作用而控制食欲。还有一种环二肽CHP(cyclo󰀁His󰀁pro)也具有调控食欲、酒精摄取、体温、水分、活动力、抗药瘾及内分泌作用。用酪蛋白、󰀁󰀁乳清蛋白、󰀁󰀁球蛋白的酶解生成的一些肽类,如Tyr󰀁pro󰀁phe󰀁pro󰀁Ile,Tyr󰀁Gly(或Leu)󰀁Leu󰀁Phe󰀁NH2等具有镇疼,促进胰岛素分泌,抑制肠蠕动等功能。国内外市场上多见的肽制品是乳蛋白肽,大豆蛋白肽(易消化性抑制胆固醇),明胶肽(调味料、饮料、美容饮料),鱼类蛋白肽,玉米蛋白肽和麸质肽,卵清蛋白肽等。不同的肽产品需用不同原料或不同酶来水解,控制水解条件,并用适当方法将所需的肽进行浓缩,这是需要一定技术的,但国内市场上有些肽类制品未经分子量划分实际上是蛋白胨。3.3󰀁酶用于酱油酿造[21,22]

󰀁󰀁酱油是蒸热大豆拌入炒热麦粉,接种曲霉作成曲子,再和入盐水保温发酵,历时2~8个月以上方成。酱油发酵的前阶段是酶反应过程,曲霉分泌的各种酶,将蛋白质、淀粉、果胶、植酸质、纤维素、半纤维素等成份水解,中后期主要是由乳酸菌、酵母菌等发酵产生风味物质,在前阶段中蛋白质水解生成肽、氨基酸等呈味成份,起关键作用的是各种蛋白酶和肽酶,还有谷酰胺酶,后者将肽等酶解产物中谷酰胺脱氨成为谷氨酸。为了缩短酿造周期,提高酱油得率,人们通过菌种选育,提高酶活力,改变酿造工艺,或补充酶制剂的方法可使发酵周期大为缩短(国内一般为15天~1个月),酱油得率有所提高,但是风

35󰀁

󰀁󰀁近年发现在蛋白酶水解蛋白质所生成的肽类中,有不少具有特殊生理功能,如降血压,降血脂、促进胰岛素分泌、活化巨噬细胞增强免疫力以及抑制血小板凝集、调控食欲、醒酒和增强机体耐力、抗疲劳等等,此外还发现氨基酸不是蛋白营养吸收的最好形式,吸收速度不如2~3肽好。最熟知的功能性肽是酪蛋白磷肽(ccp),它是一种十肽(Arg󰀁Glu󰀁Ser󰀁P󰀁Leu󰀁(Ser)4󰀁4P󰀁Glu󰀁Arg),可促进Ca、Fe之吸收,由鱼肉、大豆蛋白、酪蛋白经酶水解生成的一种血管紧张素抑制剂(ACEI),它可同血管紧张素相结合而影响其表达,从而阻止血压升高。不同蛋白质可得到各种ACEI,虽然不少降血压药中含有化学合成肽类似物的ACEI,因有损肝脏等副作用,而酶水解肽更为安全而引人重视。由玉米蛋白酶解生成的一种玉米蛋白多肽富含亮氨酸、缬氨酸以及丙氨酸等疏水性支链氨基酸和谷氨酸以及脯氨酸等而少含赖氨酸等碱性氨基酸,可缓解因肝病所致芳香族氨基酸在肝脏中的同化受阻而引起体内氨基酸不平衡所引发的肝昏迷,此外玉米蛋白肽还有健脑,降血压,抗疲劳,增强机体耐力等功能,由于它通过提高血液中Leu和Ala的浓度而稳定辅酶󰀁(NAD),故有促进乙醇代谢预防酒醉和减轻乙醇中毒的作用。由麸质蛋白水解得到的含谷酰胺的肽,与人类肠道免疫力密切有关,多食含这类肽的食品可活化巨噬细胞,提高机体免疫力而可降低感染风险。一些小肽如由pro󰀁calipase经胰蛋白酶水解生成的五肽(en󰀁

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味上还是不能同耗时长久的传统酿造酱油相比。日本不少学者对酱油酿造有关酶作了深入研讨,曾试图用酶制剂来代替传统曲法制酱油,但其风味仍不能同酿造酱油相匹敌,因为目前已知与蛋白酶分解有关的肽酶就有98种,蛋白酶有267种,产生风味的酶也非常复杂,有多少酶参与了酱油的发酵过程还不清楚,事实上也没有理想的商品酶制剂可供酱油酿造使用,因此全酶法制酱油目前还难以实现。󰀁󰀁日本龟甲万酿造公司Hawade曾在1991年开发出一种用固定化反应器生产酱油的方法,先将豆麦酶水解后作为原料,通过谷酰胺酶柱,使谷酰胺脱氨生成谷氨酸,然后导入固定化酵母和乳酸菌反应柱(所用菌种有P.halophilus,Z.rouxil,及C.ver󰀁satilis),使产生风味成份,据说采用此法只需一星期,生成之酱油可同需时6~8个月的相当,但是此法因成本关系没用于生产。3.4󰀁水解蛋白制造

󰀁󰀁蛋白水解物分为酸水解的HVP(植物蛋白水解物)、HAP(动物蛋白水解物)和酶水解物三类。水解物主要用作调味,营养品制造,酸水解产品全为氨基酸,但缺色氨酸,蛋氨酸和半胱氨酸,需要另外补充,营养价值才能完全。由于近年发现酸水解物含致癌性的3󰀁氯丙醇(3󰀁monochloropropane󰀁1,2󰀁diol,3󰀁MCPD),以致市场前景黯淡。酶水解物的组成主要是肽类和氨基酸。近年发现小肽(2~3肽)的消化吸收效率甚至高于氨基酸。多肽或小肽中还不乏具特殊生理功能之肽类。用豆粕、杂鱼、鱼下脚料等蛋白原料酶法水解蛋白质来生产保健品、营养剂、运动员饮料和调味料及饲料添加剂近来已广泛引起了人们的关注。酶法水解蛋白存在一个问题是苦味难除,影响了它的使用。不同蛋白酶的专一性不同,使用内肽酶为主的蛋白酶(例如木瓜酶,枯草杆菌蛋白酶,胃蛋白酶,碱性蛋白酶)进行水解时,苦味强烈,而用含有肽酶的米曲霉水解苦味就较少。已发现[23,24],苦味是由一些末端含有Leu,Phe及Val等疏水氨基酸的肽段所引起,苦味肽的苦味不但同其疏水度有关,而且与氨基酸序列有关,若将这些氨基酸用适当的肽酶切去,苦味乃得以消失,在蛋白质水解过程中,随着水解度的增加,苦味增强,但若水解度超过60%以后,苦味也自行减弱,一般内切酶是

󰀁

难于达到这水解度的。在日本90%的脱脂大豆是用于调味液生产的,使用纳豆菌蛋白酶和S.peptid󰀁ofaciens之肽酶水解而成,其中游离氨基酸达40%,由大日本制糖与新田明胶公司开发的明胶水解调味液是用曲霉蛋白酶水解后再用根霉蛋白酶脱苦,水解物氨基酸含量可达80%。

󰀁󰀁为适应生产无苦味蛋白质水解物的需要,日本天野制药已推出󰀁肽酶R󰀁,中酸性米曲霉蛋白酶M(最适pH4.5),新日本化学推出了肽酶Sum󰀁izymeFP(米曲霉生产的蛋白酶,含酸性羧肽酶和亮氨酸氨肽酶),Novozymes公司也推出了复合米曲霉蛋白酶Flavozyme,这种酶最适pH5~7,反应温度45~50󰀁,据说水解率可达70%而无苦味,但价格太贵(570元/公斤)。广西大学生产的风味酶是用木瓜酶配合曲霉蛋白酶制成的,江南大学也在研究。使用肽酶脱苦的同时,也会因切下一些氨基酸,致使水解物风味发生改变。除使用肽酶外,苦味的疏水氨基酸也可用吸附或萃取法去除,用其它呈味物质掩盖或用蛋白酶的plastein反应遮去疏水基末端。但不论哪种方法都还不十全十美。

󰀁󰀁除上述食品用蛋白水解物外,作为医学营养用蛋白水解物还用为苯丙酮尿症,食物过敏和慢性肝病人的调理用营养品。3.5󰀁酶在油脂工业中的新用途

󰀁󰀁酶在油脂工业中也有用武之地,除用脂肪酶水解油脂生产脂肪酸外,还有不少用途如󰀁利用脂肪酶进行酯交换改变油脂性质,例如将棕榈油通过对1,3位有专一性的固定化脂肪酶与硬脂酸进行酯交换而变成类可可脂来提高经济价值,󰀁利用无位置专一性的脂肪酶作用猪油后与烧碱反应制肥皂󰀁利用对不饱和脂肪酸脂无作用的脂肪酶水解鱼油,来浓缩高度不饱和脂肪酸的DHA与󰀁3鱼油󰀁利用磷酸酶A2分解油脂残余卵磷脂成为水溶性而除去󰀁利用蛋白酶去除动物油脂中残留蛋白,从而免除高温熬油。

󰀁󰀁榨油工业的重大革新就是近年发明利用纤维素酶,半纤维素酶和果胶酶处理植物油料,使植物组织细胞崩溃,通过离心油水分离来提取橄榄油,桔皮油和菜籽油,以代替压榨法和溶剂抽提法。3.6󰀁转谷酰胺酶(TGASE)之应用[6,29,30,31,44]

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󰀁󰀁这种酶催化酰基转移反应,它以肽链中谷氨酰胺残基󰀁󰀁酰胺基作为酰胺基供体,当受体是多肽的赖氨酸残基的󰀁󰀁氨基时,可在蛋白质分子内和分子间形成󰀁󰀁(󰀁󰀁Gln)lys共价键而交链,当受体是伯胺基时可形成蛋白质和小分子伯胺的联接,当受体是水时谷酰胺基脱氨基而生成谷氨酸残基。

󰀁󰀁利用该酶特性,可以用来改善蛋白质的结构与功能特性,如增强蛋白质之凝胶强度,改善溶解性。发泡性、乳化性,保护蛋白质分子中赖氨酸不发生美拉德反应。将Met、lys导入蛋白质提高蛋白质之营养价值,降低蛋白质食物过敏性,包埋脂类或脂溶性物质。用于不同酶分子之联结,将酶固定于高分子载体而固定化,将抗体与药物联接以及用于毛织物加工等等。利用此酶可以将边角碎肉重组而增加经济价值,增强面条面筋强度等等。

󰀁󰀁这种酶广泛存在于生物界,工业上用发酵法生产,所用菌种有茂原链轮丝菌,肉桂链轮丝菌,灰肉链轮丝菌等链轮丝菌(Streptoverticillum)和链霉菌。日本味之素公司首先开发生产,产品Tgase年销售额高达35亿日元[40]。我国江南大学亦已研究成功,中国食品发酵研究所为了提高Tgase酶活力,将产酶菌种链霉菌WZFF,L󰀁M1搭载神州飞船4号进行育种处理,结果得到6株变异菌株,产酶提高20%以上,其中一株活力达3.6u/ml,比对照提高了40%,超过了文献报道[41]。3.7󰀁酶在果蔬加工上的新用途󰀁󰀁󰀂原果胶酶用于抽提果胶

[2,6]

󰀁󰀁󰀂漆酶用于除去果汁中酚类化合物所引起之混浊。

3.8󰀁酶用于纺织业[6,27,28,36]

󰀁󰀁棉布用酶法退浆已有百年历史,随着酶制剂工业的发展,果胶酶、漆酶、蛋白酶等先后在纺织工业得到广泛应用。3.8.1󰀁棉布整理

󰀁󰀁随着牛仔服的流行,纤维素酶被大量用于棉布处理,以代替砂石洗,棉布经纤维素酶处理后,天然纤维非结晶区发生部分降解和改性,使织物柔软、光洁、手感和外观舒适。我国所用的纤维素酶为绿色木霉或里氏木霉的酸性纤维素酶,最适pH4.8,酶作用后棉布重量会减轻3%~5%,牢度会损失20%左右。但近年发现使用中性纤维素酶效果更好,具有染色后色泽反差大,棉布减量率低,酶用量少,操作容易控制,产品质量稳定等优点。国外公司已纷纷推出中性纤维素酶产品如Novozymes的DeniMax系列,Geneneor的IndiAgeNeutraL,以色列的Cel󰀁lunatCOMFORT󰀁L,󰀁ML,印度的BIOFINASENc400,PalkowashN以及其它外国公司推出的产品INDIFADEDE等等,国内还是空白。

󰀁󰀁过氧化氢酶常使用在棉布用H2O2漂泊后去除H2O2,最近发现Arthromycesramosus,鬼伞菌(co󰀁prinuscinereus)可产生大量过氧化氢酶。

󰀁󰀁果胶酶也可用于棉布整理,主要是分解棉麻织物上的果胶,以利于漂白与染色。

:果实中果胶在

󰀁󰀁漆酶是一种酚氧化酶,以氧为氢受体,牛仔布靛兰染色时用其脱色处理,漆酶还用于去除布坯上木素,Novozymes采用基因改良黑曲霉生产漆酶。󰀁󰀁棉布棉子壳残余也用木聚糖酶去除。3.8.2󰀁毛织物蛋白酶防缩处理和低温染色

[28,37]

未成熟前以原果胶形成存在,当果实成熟时才转化成可溶性果胶。原果胶在酸、热处理下可以转变成可溶性。由枯草杆菌、黑曲霉、酵母、担子菌生产的原果胶酶已被开发用来从桔皮、苹果、葡萄皮、胡萝卜中提取果胶。酶法抽提果胶工艺更简单,无污染,成本低,除含糖量稍高外,果胶质量与常法无异。󰀁󰀁󰀂真空或加压渗酶法用于桔子剥皮,罐头食品硬化[27]:在果胶酶存在下利用真空或加压浸渍果蔬,使果胶酶渗入组织而起作用,此法在欧美已广泛用于桔子剥皮和脱囊衣上。还用于桃肉硬化,将甲基果胶酯酶同Ca2+一起渗入果肉,可使罐头桃子硬度增加4倍,(因脱甲基之果胶可同Ca2+结合而增强硬度),腌制蔬菜亦可用此法增强脆性。

󰀁

󰀁󰀁毛织物如不经防缩处理,水洗后便会收缩毡化(劣质毛衣洗涤后缩水严重),防毡缩化处理已有100多年历史,过去用氯,过氧化氢,过硫酸盐处理,污染很严重。上世纪90年代才开发了无氯防缩剂。利用蛋白酶适量除去羊毛表面鳞片可提高防缩性,40年代就有人研究,60年代日本用木瓜酶防毡缩,并可降低染色温度。我们在70年代与银川工科所曾用酸性蛋白酶处理进行低温染色试验,取得较好效果,染色率提高3.6%,污水减少62%,断纱率每

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󰀁第4期

󰀁󰀁

工󰀁业󰀁微󰀁生󰀁物

第33卷󰀁

百锭降到145根,抗伸力、抗拉力、手感均明显高于对照。80年代以来日、美、英等国发表了大量论文,研究取得了一定进展,研究过的酶有胰酶、木瓜酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶等,不久此工艺会得到成熟推广。

3.9󰀁酶应用于造纸工业[6,13󰀁16,38]

󰀁󰀁酶用在造纸工业是当前酶应用的一个重要方面,造纸的打浆是利用化学、物理方法除去原料种的果胶、半纤维素、木素、树脂、脂肪和其它有机和无机物而使纤维分散的过程,其生产的污水是环境污染重要源头。随着人们环保意识的增强,对酶法造纸寄托了莫大希望。酶法造纸的关键是木素降解。近年来酶在造纸工业的应用有了较大突破,并已渗入到造纸工业各个环节,如原木脱树脂、纸浆漂白、废纸脱墨以及纤维改性等。3.9.1󰀁纸浆漂白

󰀁󰀁为了除去纸浆色素来源木素,需用氯、次氯酸、二氧化氯等处理,污染严重,为此上世纪60年代就有人试图用酶降解木素。木素是以丙基丙烷为骨架的高分子聚合物。只有破坏骨架才能使木素崩解。已经发现对木素有降解作用的酶有来自白腐菌(phanerochaete)的木素过氧化酶(LIP),锰依赖型过氧化酶(MnP)和漆酶,其中发现只有漆酶对硫酸盐和亚硫酸盐浆有较好的脱木素作用(去除率可达25%~50%)。但真正可使木素分解的木质素酶还未找到。作为一种改良法,1986年芬兰提出一种酶和化学相结合的纸浆漂白法,利用木聚糖酶切断木素同纤维间的联系物半纤维素而使木素容易除去,从而提高纸浆白度,节省漂白剂用量。此法已在欧美日本广泛使用,适用的木聚糖酶宜耐热(70󰀁)耐碱pH9~10为佳。中科院在󰀁九五󰀁期间,筛选出碱性木聚糖酶菌种,在pH7.8用于草浆处理,白度可提高4.8%,并可节约用氯量30%。3.9.2󰀁原木脱树脂

󰀁󰀁由于木材含树脂,打浆抄纸时污染设备,造成纸机车速下降、断头,影响纸张强度、堵塞设备等,因此须将原木在室外堆放数个月老化,使树脂分解,这样既影响生产周期,还占用大片土地,日本造纸研究机构对原木成份研究后发现树脂成份的96%是油酸和亚油酸,可用脂肪酶除去。此法已在90年代用于

󰀁

生产,纸品质量提高,原木堆放成本下降。树脂吸附剂用量减少,经济效益明显。当时所用酶为Novozymes供应的Lignase,在pH6~10,40~60󰀁作用。在我国南平纸厂1999年亦开始引进美国EDT公司酶法控制脂肪障碍技术,也取得良好成效。

3.9.3󰀁废纸脱墨

󰀁󰀁由于受资源和环境污染的压力,二次纤维的应用已引起各国重视,废纸浆在造纸原料中所占比例逐渐增加,在我国已增到38%,由于废纸品种繁杂,印刷油墨配方多样性,脱墨成为再生纸浆的一个难题。通常使用加碱,非离子表面活性剂,硅酸钠及过氧化氢处理来脱墨,由于污染环境,效率也并不理想。近年国外推行酶法脱墨,取得了成功。提高了油墨去除率、纸浆得率、白度和物理性能,降低了化学品使用和环境污染。所用的酶有纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶、果胶酶、漆酶和淀粉酶等。根据废纸类型选用适合的酶制剂,为了不损伤纸浆纤维强度,纤维素酶应采用无外切酶之内切酶。日本造纸公司废新闻纸脱墨,使用了碱性纤维素酶、半纤维素酶(木聚糖酶)0.1%,处理2小时,抄纸后白度比传统法高4%~5%。且纸张强度并不降低。作为󰀁九五󰀁攻关任务,山东大学等通过几年研究已研制成既适合脱墨又适用纤维性能改善的纤维素酶,这是用曲霉固体培养制造的酶,在pH5,45󰀁酶活力为0.41IU/g,脱墨剂0.5%处理30分钟,漂白处理后抄纸后,白度比化学脱墨纸浆高2%~5%。在30吨规模生产线上取得了成功。3.9.4󰀁其它

󰀁󰀁纤维素酶、半纤维素酶还用于原纤维和二次纤维质量的改善,分解纸浆中细小纤维短绒,改善纸浆滤水性、纸浆强度和抄纸性能。果胶酶之用于原木剥皮以减少机械剥皮时之能耗。3.10󰀁酶饲料添加剂[32,33,44]

󰀁󰀁酶作为饲料添加剂1923年已有报道,1960年在美国曾发表大量研究报告,使用的酶有Merck公司之Agrozyme(霉菌丝体制备之酶),Pabst公司的Zymo󰀁Pabst(枯草杆菌发酵液干物,含淀粉酶蛋白酶)[46],1975年美国首先正式使用󰀁󰀁葡聚糖酶加入饲料大麦来消除抗营养因子,取得良好效果以来,近

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胡学智:酶制剂工业概况及其应用进展

3.11󰀁酶用于化妆品[6]

第33卷󰀁

二十年来饲料酶发展迅速,国外饲料几乎都加酶,饲料酶的作用有4(1)降低胃肠道中食糜粘度以利消化酶之扩散与营养分的吸收(2)破坏饲料植物组织细胞壁,促进包在细胞内营养成份暴露和溶出以利消化(3)消除饲料中妨碍营养吸收之抗营养因子(主要是非淀粉类多糖如果胶、󰀁󰀁葡聚糖、半纤维素和植酸质等)(4)补充动物内源消化酶之不足。

󰀁󰀁饲料用酶应针对饲养动物品种,年龄和饲料组成来选择,有的该使用消化酶,有的应使用消除抗营养因子的酶。饲料添加酶后,饲养物(包括水产动物)生长快,日增重增加,死亡率下降,疾病减少,料肉比下降(平均10%左右),家禽产蛋率提高(约10%),奶牛产奶增加,饲料节省,成本降低。󰀁󰀁我国现配合饲料年产量约6500万吨,其中20%左右已加酶,用酶1万余吨,加酶饲料预计要1亿吨才够,我国饲料源不足,加酶是方向。目前常用饲料酶约20种,农业部批准使用约有12种,即蛋白酶(黑曲霉、枯草杆菌)、淀粉酶(黑曲霉、地衣芽孢杆菌)、支链淀粉酶(嗜酸乳杆菌)、果胶酶(黑曲霉)、脂肪酶、纤维素酶(里氏木霉)、麦芽糖酶(枯草杆菌)、木聚糖酶(insolens腐质霉),󰀁󰀁葡聚糖酶(黑曲霉、枯草杆菌),甘露聚糖酶(缓慢芽孢杆菌)、植酸酶(黑曲霉、米曲霉)、葡萄糖氧化酶(青霉)。植酸酶在消除抗营养因子植酸和减少磷对环境污染有重要意义,故国外饲料酶中约一半是植酸酶。国外饲料酶多为提取的酶,复合酶是由单酶配合而成。我国生产饲料酶多为固体曲粉碎而成,酶组成较复杂。自90年代以来进入中国市场的酶不下十多家,如美国之八宝威(含󰀁󰀁淀粉酶、󰀁󰀁淀粉酶、󰀁󰀁葡聚糖酶、支链淀粉酶、果胶酶和纤维素酶),芬兰之爱维生、保安生,意大利之消食露,日本之利多命,台湾的保力胺S(含菠萝酶,胰凝乳酶)等等,国内生产饲料酶的企业也有数十家,规模较大的有珠海溢多利,广州天远28饲用酶,乐地牌酶饲料添加剂,利佳多等等。󰀁󰀁由于配合饲料都采用80~90󰀁高温造粒,而一般酶在此高温容易失活,因此希望开发耐热性酶制剂,但耐热性酶一般最适宜温度也高,不适宜作饲料,可行的方法是使用热保护剂,或将酶包埋在保护材料中,再进行饲料造粒,或造好粒的酶再掺入饲料中想是现实的。

󰀁

󰀁󰀁酶在化妆品中的应用除葡聚糖酶之用在牙膏预防蛀牙,蛋白酶与SOD之于护肤品中以去除皮肤角蛋白屑和防止皮肤老化外,蛋白酶脂肪酶过氧化氢酶还用于隐形眼镜洗涤消毒液中,以消除粘附镜面上的蛋白质、脂肪和消除残余H2O2。在染发剂方面也使用酶来代替强烈的化学品,使用氧化染料染发时常用H2O2为氧化剂,高浓度之H2O2有损毛发,因此试图用作用缓和的葡糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化酶等氧化酶作为H2O2供应源,其中尿酸酶生成H2O2较稳定有望开发使用。3.12󰀁其它

󰀁󰀁利用单宁酶分解茶饮料中咖啡因与儿茶素产生之沉淀以防止混浊和脱涩。绿原酸(chlorogenacid)酯酶之用于防止果汁、蔬菜汁褐度及降低咖啡之苦味。蛋白酶、淀粉酶、脂肪加氧酶、半纤维素酶、维生素C氧化酶之用于糕点制造等等,起防止淀粉老化,增白面粉,改善品质的作用都日益得到推广。

4󰀁结束语

󰀁󰀁随着生物技术的进步,酶制剂工业与应用在近30年中日新月异,带动了社会经济的发展,遗传工程的应用,使微生物的潜能无限发挥,使许多不可思议的设想变成事实,这就是知识经济的力量。酶制剂工业的发展全赖生物技术的进步,需要投入,以Novozymes公司为例,2000年用于研发之经费达7920万美元,占全年销售额的13.9%,该公司1996~2000年的5年中获得美国专利649件,与之对比日本最大酿造公司龟甲万,年投入科研经费为3220万美元,占营业额28.4亿美元之1.13%,5年间所获美国专利为37件,虽说不少,但同Novozymes相比是少得多了,此说明投入与产出是存在正比关系的[34]。

󰀁󰀁我国酶制剂工业从无到有从小到大,成绩是有目共睹的,但技术水平、经济效益与国外相比差距很大,存在企业小、设备差、产酶水平低、产品种类少、质量差、技术含量低、应用面不广、产品结构不合理等现象,原因是多方面的:

󰀁󰀁(1)科研经费不足,自主知识产权薄弱。我国酶制剂的主要产品如糖化酶、淀粉酶、碱性蛋白酶等生

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󰀁第4期

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工󰀁业󰀁微󰀁生󰀁物

第33卷󰀁

产菌种或由进口样品分离或引进技术嫁接,很少拥有自主知识产权。改革开放以来,在政府部门支持下通过六五、七五、八五攻关大协作,取得了较大进展。但近年因体制改革企业改制等,国家投入减少,一些企业转成民营,经济力量薄弱,或无力顾及科研,或力不从心,或目光短浅只顾当前利益,这些都不利于酶制剂工业的持续发展。外资或合资企业的建立,他们以产品精良,销售服务到位等优势,其市场不断扩大,我国民族酶制剂工业该怎样办才不致淘汰?值得深思。

󰀁󰀁(2)中国酶制剂工厂太多、太小、太散,盲目投资,低水平重复生产,有些是私下搞到菌种,就筹资开厂,正像丹麦人KA先生说的[35]󰀁有几百家酶生产商在中国注册,但大多数只能称作乡村作坊,规模很小,由农民管理,只要有大专院校或政府部门帮助就可以生产酶的粗产品,󰀁󰀁,这些小企业通常有相当灵活性但资金紧张,又没有什么眼光󰀁󰀁󰀂,三十年来开开关关,很少坚持下去。因水平低,染菌多,既浪费物资又污染环境,有不少厂投资数百万,有的一天也没正式开过工就关门了,有的虽稍具规模又因其它原因关门,造成巨大浪费。此现象近来有所改善但政府部门应当坚持加强管理,不能放任自流。󰀁󰀁(3)酶制剂的产生工艺有液体深层培养和固体曲法培养二种,我国酶制剂厂除饲料酶外,几乎一边倒地用深层培养法生产,其实固体培养有不少优点:如投资少、动力消耗低、染菌威胁少,管理容易,环境污染少,单位容积产酶量高,有些酶和菌种更适合于用固体培养法生产,固体培养起源于东方,不能认为是落后工艺,近年已引起欧美各国重视,日本新日本公司的各种酶就是采用固体培养法生产的,产品是世界一流的,丝毫不逊色于欧美大公司,关键是要解决机械化制曲生产,中科院过程工程研究所

[42]

是理想的合作伙伴󰀁。宏达厂生产的耐高温󰀁󰀁淀粉酶经NOVO方面测试,性能良好相当于NOVOTermamylL1󰀁60[35]。可见中国人依靠自身努力,借鉴国外经验完全有能力建设一个现代化的酶制剂行业。

󰀁󰀁为了我国酶制剂行业的继续发展,赶上国际先进水平,国家应继续加强领导,集中国内有关科研、大学、人力、财力成立一、二个酶工程研发中心,与酶制剂行业共同努力实现我国酶制剂工业十五和2015年发展目标:以市场需求为导向,调整行业结构,深化改革开放,实现行业创新;提高产品技术含量,增加品种;提高质量,做好综合利用和环境保护,实现社会效益、企业效益和环境效益三个同步发展[45]。

参

考

文

献

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、常

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󰀁󰀁(4)中国的酶制剂工业是有希望的,正如󰀁诺维信在中国󰀁一书中NOVO公司高层专家参观了苏州宏达酶制剂厂(七五攻关成果之一)后的感想:󰀁苏州宏达酶制剂厂是他们迄今在中国考察过的酶制剂厂中,生产和环境条件,技术和管理水平最好的工厂,

󰀁

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Generalsituationsofenzymepreparationindustryand

itsapplicationdevelopments

HUXue󰀁zhi

(ShanghaiInstituteofIndustryMicrobiology,Shanghai200233)

Abstract󰀁Thegeneralsituationsofenzymepreparationindustrybothathomeandabroadwereoutlinedandtheapplica󰀁tiondevelopmentsofenzymepreparationwereintroduced.Inaddition,thefurtherexpansionofchineseenzymeprepara󰀁tionindustrywasprospected.

Keywords󰀁enzymepreparation;industry;application

󰀁41󰀁