骨髓液中FGF-1、Smad3表达与再生障碍性贫血发病的关系研究

蓝 轶，范文霞，黄建清［摘要］目的 探讨骨髓液中成纤维细胞生长因子1 (fibroblast growth factor 1, FGF-1)、Smad3表达与再生障碍性贫血 (aplastic anemia, AA)发病的关系。方法 选取2013年2月一2016年1月自贡市第二人民医院收治的50例AA患者作为研究

组，选择同期来医院体检的40名健康人作为对照组，均行骼后上I#穿刺，提取骨髓液5 ml,均测定FGF-1,转化生长因子01 (transforming growth factor pi, TGF-pi)、Smad3表达情况，比较2组骨髓MSC中TGF-pi, Smad3表达水平、骨髓MSC分

泌细胞培养上清中TGF-门及FGF-1 ELISA检査结果，并观察TGF-pl, FGF-1对MSC成脂分化及增殖的影响，据此分析FGF- 1, Smads表达与AA发病的关系。结果 研究组患者MSC中TGF-01及Smad3蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05) , ELISA 检査研究组TGF-pi、FGF-1含量均低于对照组(P<0.05) , AA患者骨髓MSC培养4 d后即出现大量脂滴细胞，滴加TGF-01、 FGF-1培养20 d后均未出现或少见含脂滴细胞。结论 AA患者骨髓液FGF-1, TGF-pi, Smad3表达水平均较低,可诱导MSC

脂质分化，而添加FGF-1、TGF-P1可抑制AA患者MSC向脂肪细胞分化。［关键词］再生障碍性贫血,成纤维细胞生长因子-h Smad3［中图分类号］R552 ［文献标识码］A ［文章编号］2095-3402 (2019) 04-320-04DOI： 10.3969/j .issn.2095-3402.2019.04.013Relationships between expressions of FGF-1 and Smad3 in bone marrow fluid and pathogenesis of aplastic anemiaLAN Yi*, FAN Wenxia, HUANG Jianqing. *Oncology, Department of Hematology, Zigong Second People's Hospital, Zigong Sichuan 643000, China［Abstract］ Objective To investigate the relationships between the expressions of fibroblast growth factor -1 (FGF-

1) and Smad3 in bone marrow fluid and the pathogenesis of aplastic anemia (AA) . Methods A total of 50 patients with AA treated in our hospital between February 2013 and January 2016 were selected as the study group, while another 40 healthy people were selected as the control group. All these subjects underwent posterior superior spine puncture. 5ml of bone marrow fluid was extracted to determine the expressions of FGF-1, transforming growth factor- p 1 (TGF- p 1) and

Smad3. The expressions of TGF- p 1 and Smad3 in the bone marrow MSCs and the ELISA results of TGF- p 1 and FGF-1 in the culture supernatant of bone marrow MSCs were compared between the two groups, the effects of TGF-^1 and FGF-1 on MSC adipogenic differentiation and proliferation were observed, and the relationships between the expressions of FGF-

1 and Smads and the pathogenesis of AA were analyzed. Results The expression levels of TGF-131 and Smad3 protein in MSC of the study group were lower than those in the control group (P<0.05), so were the ELISA results of TGF- p 1 and

FGF-1 (P<0.05) . A large number of lipid droplets were found in the bone marrow of patients with AA after 4 days of MSC culture, but few or no lipid droplets were found after adding TGF- B1 and FGF-1 and 20 days of culture. Conclusion The expression levels of FGF-1, TGF-Bl and Smad3 in bone marrow fluid of patients with AA are low, which can induce the

differentiation of MSC lipids. The addition of FGF-1 and TGF-卩 1 can inhibit the differentiation of MSC from patients with AA into adipocytes.［Key words］ aplastic anemia; fibroblast growth factor -1; Smad3基金项目：四川省卫生和计划生育委员会科技基金资助项目(17PJ526)作者单位：643000四川自贡，自贡市第二人民医院肿瘤血液科(蓝轶、黄建清)；830054乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院血液病中心 (范文霞)空军医学杂志 2019 年8月第35卷第4期 Medical Journal ofAir Force, Vol.35, No.4, August, 2019• 321 •再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)是临床 常见骨髓造血功能衰竭性血液疾病，以全血细胞减

少、骨髓造血细胞增生明显减少为特点，患者常伴贫

血、感染等症状旳。流行病学资料显示，AA发病率约

为2/10万，中青年居多，男性发病率略高于女性叫目

前尚未完全明确AA的发病机制，早期多认为与造血

干细胞自身功能缺陷、免疫损伤等有关近年来发

现，骨髓造血微环境改变在AA发病中重要作用旳。成

纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)

家族是参与人体造血系统调节的关键因子，在骨髓造

血微环境平衡维持及血细胞生成过程中有重要作用， 成纤维细胞生长因子1 (fibroblast growth factor 1,

FGF-1)是FGFs家族重要成员，研究发现其在血管生

成、损伤修复、骨骼生长、胚胎发育等过程均有重要作

用，且与造血功能关系密切切。Smad3则为转化生长 因子01 (transforming growth factorP1, TGF-pi)信 号传导的下游信号分子，在TGF-pl生物学效应传递

中有关键作用，可将TGF- p 1与其受体结合所产生的

信号传递至细胞核内，调控T细胞发育、稳定、活化及

耐受，Smad3蛋白缺失，导致TGF-pl/Smad3通路阻

断,导致血液白细胞减少，加速骨髓细胞清除速度，影

响其造血功能同。为此，为进一步分析骨髓液FGF-1,

Smad3表达与AA发病的关系，现对自贡市第二人民医

院收治的50例AA患者及40例正常健康人展开研究，

报道如下。1对象与方法1.1对象选取2013年2月—2016年1月我院收治的 50例AA患者作为研究组。纳入标准：符合再生障碍

性贫血诊断标准⑴，伴持续骨髓低增生性血细胞减 少，外周血累及2系血细胞减少，血小板<50xl()9/L或 中性粒细胞低于1.5xlO°/L或血红蛋白低于10 g/dl,均

经骨髓细胞学确诊；未接受输血或免疫抑制剂治疗；

获得患者知情同意。排除标准：合并心、肝、肾、肺器

质性功能障碍者，合并恶性肿瘤者；合并严重精神障

碍者；合并其他血液系统疾病者；骨髓纤维化或血细

胞发育异常者。选取同期来医院体检的40名健康人 作为对照组，均经体检证实身体健康，无血液系统疾 病，均获得骨髓液标本。研究组男28例，女22例，年

龄10~49岁,平均(28.6±5.7)岁；病程1~105个月， 平均(40.1±20.2)个月，病情程度：轻型23例，重型

27例。对照组中男22人，女18人；年龄9〜48岁，平均 (27.9±4.7)岁。1.2 主要试剂与仪器 鼠抗人TGF-01、Smad3、P -actin抗体(Maxim公司，美国)，抗兔免疫球蛋

白G (IgG)、抗山羊IgG (BD公司，美国),小鼠抗人

FGF1抗体(Santa Cruz公司，美国)，磷酸盐缓冲液 (PBS) TGF-P1酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒、FGF-1 ELISA试剂盒(R&D公司，美国)，电化学发

光检测试剂盒(Amersham公司，美国)；Elx-800型

酶标仪(Dynex公司，美国)，KH200型蛋白定量扫描 仪(Biometra公司，德国),IX51-UPH型倒置显微镜

(Olympus公司,日本)。1.3方法研究组所有患者入院后均行骼后上暗穿 刺，提取骨髓液5 ml,釆用密度梯度离心法分离骨髓

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC),采

用蛋白质印迹法测定TGF-01、Smad3表达情况，取

MSC经PBS洗涤2次，细胞裂解液裂解，离心后取上

清液，低温保存，测定蛋白质浓度，转移至硝酸纤维

膜，加小鼠抗人TGF-肌、Smad3、B-actin抗体，彻底

洗膜，加过氧化物酶标记的抗兔IgG或抗山羊IgG抗

体，采用电化学发光法试检测试剂盒检测反应蛋白，

显影，采用蛋白定量仪测定蛋白条带相对表达量(所

测蛋白/P-actin比值)。并取无MSC细胞上清液，采用

ELISA法测定TGF-p, FGF-1表达水平，严格参照试

剂使用说明进行操作。同时MSC细胞经胰酶消化， 接种于96孔板，放入脂肪细胞诱导培养基内培养，

加入浓度为15 ng/ml的TGF-01或FGF-1 (上海科

兴商贸有限公司，中国)，并以未额外添加TGF-pl 或FGF-1作为空白对照，诱导分化20 d,采用倒置显

微镜观察成脂分化情况，油红O染色法鉴定脂肪细

胞，观察TGF-pl, FGF-1对AA患者成脂细胞分化

及增殖的影响。1.4统计学处理应用SPSS 20.0软件对数据进行统

计分析，计量资料以工土 s表示，采用r检验，计数资料

以率(％)表示，进行才检验，以P<0.05为差异有统计 学意义。2结果2.1骨髓MSC中TGF-Bl、Smad3表达情况比较研究 组患者MSC中TGF- p 1及Smad3蛋白表达水平均低于 对照组(图1,2).2.2 骨髓MSC分泌细胞培养上清中TGF-pl及FGF-1 的ELISA检查结果比较研究组TGF- Pl, FGF-1的

ELISA检查结果均低于对照组，比较差异有统计学意

义(P<0.05)(表1)。・322・空军医学杂志 2019年 8 月 第35 卷 第4期 Medical Journal ofAir Force, Vbl.35, No.4, August, 2019对照组 研究组tgf-pi注，MSC, M充质干细胞,TGF-pi：转 注,MSC：间充质干细胞化生长因子01Si健康人与再生隔鹹血患者图2健屣人与融刪矗血患者#®MSC 中 Smad3ai4情况表1 2组骨髓MSC分泌细胞培养上清中TGF- 01及FGF-1的ELISA检

査结果比较（卫士s）组别TGF-pi (gg/L)FGF-1 (ng/L)研究组5=50）3.41 ±0.9632.21 土6.51对照组（»=40）11.65±1.2570.25 土 8.44f值35.37624.143尸值0.0000.000注，MSC：间充质干细胞，TGF-01,转化生长因子01, FGF-1,成纤维细胞生

长因子12.3 TGF-pi、FGF-l对MSC成脂分化及增殖的影响AA

患者骨髓MSC培养4 d后即出现大量脂滴细胞（图3）,

滴加TGF-01培养20 d后均未出现含脂滴细胞（图4）；AA患者骨髓培养4 d后即显示MSC已分化为脂肪细胞

（图5）,添加FGF-1后其分化诱导20 d后骨髓MSC分化 脂肪细胞明显减少,几乎未分化脂滴细胞（图6）。图3 未额外添加TGF-01 BB4 额外添加15ng/ml TGF-01

（X200）分化诱导20 d后(X200)图5未额外添加FGF-1（油图6 WK&nl5ngtal红O脂却包X200）20诟(JteEO脂类染色，X400)3讨论再生障碍性贫血系一组以化学、生物及物理等 多类因素所致骨髓功能衰竭性疾病，属常见难治性

血液病。目前认为造血干细胞/祖细胞自身功能缺陷、

免疫功能损伤及造血微环境损伤是引起AA的主要

机制闻，而脂肪化则为AA患者骨髓典型病理特征，

Bacigalupo[9]发现，AA患者骨髓造血细胞数量明显降

低，而脂肪细胞数量显著增加，该观点认为骨髓腔内

脂肪细胞的变化与AA骨髓MSC分化有关。推测造血 干细胞/祖细胞功能受损或免疫损伤对造血微环境基

质前体细胞产生影响，削弱其造血因子分泌功能，同

时导致其向脂肪细胞分化。TGF- p 1为调节细胞增殖及分化的TGF- 0超家族

成员何，由T淋巴细胞分泌，系机体免疫调节的关键因

子，同时参与自身免疫耐受及T细胞稳定性的调节过

程，其中TGF- p 1信号分子主要对TGF- p、TGF- P受体

及细胞内信号分子Smad3产生调节作用，导致内源性

TGF-P内源性分泌丢失，降低细胞对TGF-P反应性，

阻滞信号传递叩。李文静等问表示，AA患者血循环内

TGF-B1水平降低可能参与AA的发病过程。而Smad3

则为TGF- p 1受体的重要底物，可将TGF- p与受体结

合后信号传递至细胞核，调节靶基因转录。有学者通

过临床研究发现，敲除Smad3基因的小鼠免疫缺陷明

显问。本研究发现，AA患者MSC中TGF-B1及Smad3

蛋白表达水平均较正常健康人低，而进行脂肪分化实

验发现，TGF- p 1可抑制MSC分化，提示TGF- 01信号

传导通路异常,TGF- p 1及Smad3表达下调MSC向脂肪

细胞分化产生影响，而上调Smad3及TGF-10表达可抑

制MSC向脂肪细胞分化。FGF-1则属FGFs家族关键成员，系多肽类活性物

质，是调节造血功能的重要细胞因子，可促进造血细

胞有丝分裂，促进血细胞增殖，调控间质干细胞分化，

同时参与血管修复、营养神经等过程。大部分FGFs含

信号序列，并以自分泌及旁分泌的形式与受体结合并

激活该受体，发挥其生物学功能。谷依学等网自分泌

的FGF-18可与FGF1、FGF2受体结合介导成骨分化。

同时也有研究者表示，FGF10可以旁分泌的形式激活

FGF2受体，引起成脂分化问。但对FGF-1在干细胞成

脂分化中的作用则尚未见报道。本研究发现，AA患者

骨髓FGF-1表达水平明显低于正常健康人，且在额外

添加FGF-1后,骨髓分化脂肪细胞减少，提示FGF-1可

抑制骨髓MSC成脂分化，与TGF-P1作用类似。综上所述，再生障碍性贫血患者骨髓液FGF-

l,TGF-pi, Smad3均处于低表达水平，是引起AA

患者造血微环境异常的重要原因，而添加FGF-1、空军医学杂志 2019年8月 第35卷 第4期 Medical Journal ofAir Force, Vbl.35, No.4, August, 2019・323・TGF-01、Smad3可抑制MSC向脂肪细胞分化。【参考文献】Acta Haematol, 2017, 138 ⑵：119-12&[9] Bacigalupo A. How I treat acquired aplastic anemia[J], Blood,

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以下肢和腰部伤病常见；提示对常驻高原部队官兵应

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