基因工程生产蛋白

基因工程法生产多肽和蛋白类药物，系指将合成多肽或蛋白的基因分离纯化后，结合上合适的表达载体转入它种生物并稳定遗传和表达的过程。基因工程法生产多肽和蛋白类药物包括基因工程菌(细胞)构建、发酵(或细胞培养)、分离纯化、检验及制剂等环节，其中基因工程菌(细胞)构建至为关键。基因工程菌(细胞)常用的宿主菌(细胞)包括微生物和真核生物细胞，最常用的有大肠杆菌、酵母菌和中国仓鼠卵巢细胞，其中尤以大肠杆菌和酵母菌最为普遍，是本章介绍的重点。

一、生产用微生物的来源及发酵特性

生产用微生物主要来源于两个方面，一是从自然界分离，二是人工改良。从自然界分离到的微生物由于受自身代谢调节的控制，蛋白类药物的合成量十分低。另外，自然界中的微生物合成的蛋白质药物各类也十分有限。为了提高蛋白类药物的产量，丰富其种类，对自然界分离的微生物进行改良成为必然。改良方法主要有人工诱变法和基因工程法，其中尤以基因工程方法用得最为普遍。

基因工程方法改良微生物，就是通过把某一特定的外源基因，通过一定的载体，放入宿主细胞内，使之随宿主细胞的生长和繁殖一起复制和表达。外源基因的表达产物属于异已物质，并可能对宿主细胞有毒性。大量的外源基因表达产物可能打破宿主细胞的生长平衡，如大量的氨基酸被用于合成与宿主细胞无关的蛋白质，从而影响其他代谢过程。有的表达产物本身对细胞有害，表达产物的大量积累可能导致细胞生长缓慢甚至死亡。由于基因工程产物在细胞内过量合成，必然会影响宿主的生长和代谢，而细胞生长受限，又反过来抑制了外源基因产物的合成。所以必须合理调节这种消长关系，使宿主细胞的代谢负荷不至于过重，又能高效表达外源基因。

为了减轻宿主细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，可以采取当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因表达的措施。即将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，使表达产物不会影响细胞的正常生长，当宿主细胞的生物量达到饱和时，再进行基因产物的诱导合成，以减低宿主细胞的代谢负荷。

基因工程常用宿主菌有大肠杆菌和酵母，用不同的宿主菌，其后续的发酵方法会有所差别，现分别介绍这两类常用宿主菌的特性如下。

1．大肠杆菌宿主菌特性

大肠杆菌一直是基因工程中应用最广泛的表达系统，这主要因为大肠杆菌有以下两个方面的优点：一方面，大肠杆菌的遗传背景清晰，人类已经对大肠杆菌的遗传特性了解的十分清楚，不会产生安全问题；另一方面，大肠杆菌繁殖快，能够在普遍培养基上快速生长，容易培养，有利于降低生产成本。

当外源基因进入宿主菌后进行复制与表达所需的原料和能源，如合成蛋白质的氨基酸、合成DNA和RNA的核苷酸以及复制和翻译的工具等，都必须要靠宿主细胞提供，这必然会增加宿主细胞的负担。为了

减轻外源基因表达对大肠杆菌宿主细胞造成的压力，一般要对外源基因的复制和表达进行调控，其中最重要的是对其表达的调控。借助表达调控的控制，在大肠杆菌生长时，关闭外源基因的表达，当细胞生长达到要求的密度后，再借助一定的调控措施，启动外源基因的表达，合成所需产物。大肠杆菌中，常用表达调控方式有温度型启动子和乳糖操纵子型启动子两种。这两种启动子都在外源基因载体上，刚好处于外源基因的上游，可以启动其下游的外源基因的转录表达。

温度型启动子来源于λ噬菌体，受cI阻遏蛋白抑制。cI蛋白由CIts857基因（857bp长）编码，该基因的表达与温度高低相关，当温度处于低温（一般37℃以下）时，该基因能活跃地表达出cI蛋白，抑制住由温度型启动子启动的基因的表达。一旦温度升高到42℃，该基因的表达关闭，不会合成cI蛋白，就解除了对温度型启动子的抑制作用，从而启动位于其下游的外源基因的表达。这正是温度型启动子调节外源基因表达的原理。国内重组的γ干扰素工程菌，正是利用的这一原理进行表达调控的。

乳糖操纵子型启动子调控外源基因表达的原理是借用乳糖操纵子启动子的特性，即必须经过乳糖诱导才能启动。将这种类型的启动子置于外源基因的上游，就可以通过乳糖的添加与否，来控制外源基因表达的开关。当工程菌生长繁殖时，培养基中没有乳糖，乳糖操纵子启动子不会受到诱导而关闭，外源基因不表达。当达到所需的工程菌密度后，向培养基中加入乳糖或乳糖的类似物，对其进行诱导，就可以开启外源基因的表达。必须注意的是，乳糖操纵子型启动子在添加乳糖启动外源基因表达时，培养基中一定不能含有葡萄糖。葡萄糖的存在，会有抑制作用。要消除这种抑制作用，可选择培养基中葡萄糖消耗完时再添加乳糖，或将细胞离心出来，再悬浮于仅含乳糖为唯一碳源的培养基中。国内有很多以大肠杆菌为宿主菌的工程菌，均采用此法进行外源基因表达调节控制。

大肠杆菌作为宿主菌进行外源基因表达的一个最重要的特点是大肠杆菌作为原核生物，不存在真核生物才具有的蛋白质正确折叠、剪切和修饰的工具，因此，当真核中的基因在大肠杆菌中表达时，表达出来的蛋白质一方面因为没有折叠工具的帮助，不能形成正确的折叠，以包涵体的形式存在，需要分离纯化后将肽链散开后重新进行折叠；另一方面，有些真核生物的蛋白质必须要经过修饰（例如糖基化）后才能有生物活性，而大肠杆菌由于不具备这样的能力，这类型在蛋白质就不能在大肠杆菌中表达。

2．酵母菌宿主菌特性

酵母菌作宿主菌最常用的是巴斯德毕赤酵母，亦称之谓甲醇酵母。该酵母的最大特性是能利用甲醇为唯一碳源进行生长代谢。甲醇酵母之所以能利用甲醇作为唯一碳源生长，主要是因为该酵母细胞内存在甲醇氧化酶基因AOX1，该基因属于诱导型，其启动子只有在存在甲醇为唯一碳源的前提下，才能启动表达AOX1基因并翻译为甲醇氧化酶。正是利用该启动子能被甲醇诱导的特点，将需要表达的外源基因置于含有AOX1启动子的载体上，使之受AOX1启动子控制。含有这类型的外源基因，当酵母在普通碳源（如葡

萄糖、淀粉、乳糖等。）上生产时，由于不存在甲醇的诱导，外源基因的表达处于关闭状态，此时的基因工程甲醇酵母细胞，由于没有表达外源基因的负担，可以快速生产，提高酵母细胞密度。当细胞达到一定的密度后，且不存在其它碳源或其它碳源消耗殆尽后，向培养基中加入一定浓度的甲醇，在甲醇的诱导下，酵母细胞才开始表达，合成所需的蛋白药物成分。

甲醇酵母或巴斯德酵母生长速度快，能获得较高的细胞密度，可有效提高产物的合成量。另外，在AOX1启动子的控制下，外源基因在甲醇酵母中的表达量也很高，产生的蛋白质能占到酵母细胞总蛋白的5－40%。例如，破伤风毒素蛋白在甲醇酵母中表达时，可获得产物浓度达12g/L。甲醇酵母表达的蛋白药物，与人体的蛋白结构相近，有利于减少药物使用后的免疫原性问题。这主要是因为甲醇酵母存在类似于人体细胞那样的蛋白修饰系统，例如，能对蛋白药物进行N－和O－糖基化修饰，能主动切除原核细胞表达蛋白所特有而真核细胞不具有的甲硫氨酸。

1． 基因工程菌发酵控制要点 （1）培养基

培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油时菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。乳糖对lac启动子有利。在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对trp启动子控制的基因有影响。无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。

（2）接种量

接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。

（3）温度

温毒对基因表达的调控作用发生在复制转录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。 温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产。温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。

（4） 溶解氧

对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下降，发酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。采用调节搅拌转速的方法。可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。

（5）诱导时机

对于λPL启动子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的温度敏感型突变株（clts857），在28～30℃下培养时，该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录；当温度升高42℃时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目的基因的表达效率。一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。在对数生长期，细胞快速繁殖，直到细胞密度达到109/个为止，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。

（6）pH

pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，其最佳pH在6.8～7.4左右；培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件，其最佳pH为6.0～6.5。

基因工程菌发酵与传统的微生物发酵工业相比，生产规格要小得多。传统微生物发酵属于大工业化发酵，通常一个发酵罐体积小的有几十个立方米，大的有超过200立方米的。例如，抗生素和氨基酸发酵生产都是如此。然后，基因工程菌使用的发酵设备多为中小型，体积从几升至1立方米不等，很少有超过10立方米的。这主要是因为在大型发酵罐内的各个部位，各工艺参数难以控制均匀，容易引起基因工程菌不稳定，导致生产失败。

二、干扰素的生产工艺 （一）特性、结构与功能

干扰素是由诱导剂诱导人体细胞而产生的一类高活性多功能蛋白。干扰素被诱导合成和释放后，再作用于同种生物细胞，使其获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力。1980年，国际干扰素命名委员会对干扰素进行定义为：干扰素是一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质。目前，干扰素一般是指脊椎动物细胞进过诱导后所产生的一类具有细胞调节功能的蛋白质。干扰素的英文名称为interferon，通常简写为IFN－。

按照结构和来源方面的差异，可将干扰素分为3类，即α-干扰素、β－干扰素和γ－干扰素。其中，α-干扰素来源于白细胞，也有部分类淋巴细胞能合成，简写为IFN－α；β－干扰素来源于成纤维细胞及

部分类淋巴细胞，简写为IFN－β；γ－干扰素来源于T细胞，简写为IFN－γ。根据各类干扰素的细微结构，还可以对干扰素进一步细分为亚类，例如，IFN－α可再进一步细分为IFN－αIb、IFN－αIIa、IFN－αIIb等亚类。

各型干扰素的理化性质如见下表。

表4－5 各型干扰素的性质比较

性 质 分子质量/kD 活性分子结构 等电点 已知亚型数 氨基酸数 pH＝2.0的稳定性 热（56℃）稳定性 对0.1%SDS的稳定性 在牛细胞（EBTr）上的活性 诱导抗病毒状态的速度 与ConA-sepharose的结合力 免疫调节活性 抑制细胞生长活性 种交叉活性 让要诱发物质 主要产生细胞 IFN－α 20 单体 5－7 >23 165－166 稳定 稳定 稳定 高 快 小或无 较弱 较弱 大 病毒 白细胞 IFN－β 22－25 二聚体 6.5 1 166 稳定 不稳定 部分稳定 很低 很快 结合 较弱 较弱 小 病毒，PolyI:C等 成纤维细胞 IFN－γ 20,25 四聚体或三聚体 8.0 1 146 不稳定 不稳定 不稳定 不能检出 慢 结合 强 强 小 抗原、PHA等 淋巴细胞 此外，干扰素还有一些普遍的共同性质，例如，沉降率低，不能透析，容易被胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等蛋白酶破坏，能抗DNase和RNase等核酸酶的降解。

IFN－αIb含有166个氨基酸残基，其中包括5个半胱氨酸（Cys），其中4个形成两个二硫键，另一个没有形成二硫键，游离的巯基（－SH）容易引起分子间交联，形成二聚体。相对分子质量为19329。等电点位于5－6之间。

IFN－αIIa含有165个氨基酸残基，只含有4个半胱氨酸，形成两个二硫键，不存在游离的巯基，故不易形成二聚体。等电点与IFN－αIb一样，介于5－6之间，但其稳定性则要较IFN－αIb强，特别是对

酸和热的稳定性，明显强于IFN－αIb。

IFN－αIIb的结构与IFN－αIIa相似，仅有一个氨基酸的差异，即IFN－αIIa第23位的氨基酸残基为赖氨酸，而IFN－αIIb第23位则为精氨酸。这一个氨基酸的差异，并为引起性质的显著变化，IFN－αIIa与IFN－αIIb的性质完全相似。

干扰素作用为人体防御系统最重要的组成成分之一，其作用主要有： ①抑制病毒等细胞内生物的增殖； ②抗细胞增殖；

③通过作用于巨噬细胞、NK细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞而进行免疫调节； ④改变细胞表面状态，使细胞表面负电荷增加，并增加组织相容性抗原表达； ⑤增加细胞对双链DNA的敏感性。

研究表明，IFN－α可抗血液中的艾滋病毒、肝炎病毒；IFN－β能有效治疗病毒引起的带状疱疹，并对乳腺癌、肾细胞癌、恶性黑色素瘤也具有辅助治疗作用；IFN－α、IFN－β与IFN－γ三者联合应用可增强抗肿瘤的效果。在临床上，干扰素主要用于：

①病毒性疾病，例如普通感冒、疱疹性角膜炎、带状疱疹、水痘、慢性活动性乙型肝炎； ②恶性肿瘤，例如对成骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾细胞癌、鼻咽癌等能起到部分缓解的作用；

③用于病毒引起的良性肿瘤，控制疾病发展。 （二）生产工艺

干扰素生产的传统方法是对能诱导产生干扰素的细胞进行培养，例如人白细胞、成纤维细胞、T淋巴细胞等，然后通过诱导剂进行诱导，然后再进行分离除杂，获得干扰素产品。这种方法由于要进行人的细胞培养，操作起来非常麻烦，产量低，成本高，因此，逐渐被现代的基因工程菌发酵所代替。

目前我国临床上使用的干扰素品种有IFN－αIb、IFN－αIIa、IFN－αIIb等，其中多以大肠杆菌为宿主菌，只有IFN－αIIa采用酵母作为宿主菌。下面以IFN－αIIb为例，介绍干扰素生产工艺过程

1．干扰素IFN－αIb基因工程菌的构建

干扰素IFN－αIb基因工程菌的构建过程如图4－6所示。

图4－6 干扰素IFN－αIb基因工程菌的构建过程

在国内，从事干扰素研究的机构有中国预防医学科学院病毒学研究所、卫生部上海生物制品研究所、卫生部长春生物制品研究所和中国药品生物制药检定所等。IFN－αIIb是我国开发成功进行产业化生产的

第一个干扰素品种，也是我国第一个基因工程药物品种，由长春生物制品研究所研究开发。

2． 基因工程干扰素的生产工艺

生产基因工程α－干扰素的工艺流程如图4－7。

图4－7基因工程干扰素-αIIb生产工程流程图

（1）发酵

①生产种子 人干扰素IFN－αIIb的生产菌种用得是以大肠杆菌为宿主菌的基因工程菌。一般用温度敏感型启动子调控干扰素IFN－αIIb的表达过程。

②种子培养基 1%蛋白胨、0.5%酵母抽提物、0.5%NaCl，pH7.0，121℃灭菌15分钟。

③种子摇瓶培养 在4个1L三角瓶中，分别装入250mL种子培养基，按要求灭菌后，分别接种人干扰素IFN－αIIb基因工程菌，30℃摇床培养10h，作为发酵罐种子使用。

④发酵培养基 1%蛋白胨、0.5%酵母抽提物、0.01%NH4Cl、0.05%NaCl、0.6%Na2HPO4、0.001%CaCl2、0.3%KH2PO4、0.01%MgSO4、0.4%葡萄糖、50mg/mL氨苄西林、少量消泡剂。添加氨苄西林的目的是防止污染杂菌。干扰素基因工程菌所用载体上含有一个氨苄西林抗性基因，使该基因工程菌不受氨苄西林的抑制，而其它杂菌，或失去载体的退化菌，由于不含氨苄西林抗性基因，将不能生长。

⑤发酵 用15L发酵罐进行发酵，发酵培养基的装量为10L，pH6.8，搅拌转速500r/min，通风比为1：1m3/(m3?min)，溶氧为50%。控制温度30℃发酵培养8小时。在该时间内，温度敏感型启动子受cI蛋白抑制而被关闭。待菌体量充足后，提高发酵温度至42℃，诱导启动子开启，启动干扰素基因的转录和翻译，合成干扰素产物。诱导时间大约3小时，就可以完成发酵。

（2）产物的提取和纯化

①提取 干扰素发酵结束后，冷却，离心（4000r/min）30min，除去上清液，收集湿菌体，约1000g左右。将上述湿菌体重新悬浮于5L 20mmol/L磷酸缓冲溶液（pH7.0）中，于冰浴条件下进行超声破碎。由于大肠杆菌中不含真核细胞中所具有的一些帮助蛋白质折叠的细胞因子，因此合成的干扰素IFN－αIIb以包涵体形式存在。包涵体是水不溶性的，细胞破碎后释放出来的包涵体可用离心方法分离。离心条件为4000r/min30min，取沉淀部分，用1L含8mol/L尿素、20mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）、0.5mmol/L二巯基苏糖醇溶液，室温搅拌2h，使包涵体溶解。在溶解过程中，干扰素IFN－αIIb包涵体的肽链会局部打开后重新折叠，形成正确的有生物活性的干扰素IFN－αIIb空间构象。溶解后，再15000转离心30min，去除不溶物（其中主要是细胞碎片），收集含有可溶性干扰素IFN－αIIb的上清液，用20mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）稀释至尿素浓度为0.5mol/L，加二巯基苏糖醇至0.1mmol/L，4℃搅拌15h，15000r/min离心30min，除去不溶

物。

上清液经截留量为104相对分子质量的中空纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素IFN－αIIb溶液经过葡萄糖凝胶柱（Sephadex G-50）分离。上柱前，层析柱（2cm×100cm）先用20mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）平衡。上柱后，用同一缓冲液洗脱分离，收集人干扰素IFN－αIIb部分。

②纯化 将经Sephadex G-50柱分离的人干扰素IFN－αIIb组分，再经DE－52柱（2cm×50cm）纯化，人干扰素上柱后用含0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/LNaCl的20mmol/L磷酸缓冲溶液（pH7.0）分别洗涤，收集含人干扰素αIIb的洗脱液。全过程蛋白质回收率20－25%，产品不含杂蛋白、DNA及热原质，符合质量标准。DE－52柱为离子交换纤维素柱，DE－52是离子交换柱填料纤维素的型号。

（三）质量检验

基因工程干扰素半成品检定主要包括的项目有：效价测定、蛋白质含量及比活测定、纯度、相对分子质量、残余外源性DNA含量、残余外源性IgG含量、残余抗生素活性、紫外光谱扫描、肽图测定、等电点、无菌实验、热原实验、安全性实验等。详细的测定方法请参照《中华人民共和国药典》中的有关章节。

三、白细胞介素2和白细胞介素 （一）特性、结构和功能

白细胞介素的英文名称为interleukin，简称IL，具有介导白细胞间相互作用的功能，属于淋巴因子家族的一员。目前已有白细胞介素29种，按发现的前后，依次称为IL－1~29。白细胞介素除了介导白细胞的相互作用外，还部分参与了其他细胞的相互作用，如造血干细胞、血管内皮细胞、纤维母细胞、神经细胞、成骨细胞和破骨细胞等。目前对IL－1~6研究得较多，6种IL的主要生物化学特性见表4－6。

表4－6 6种白细胞介素的生物化学特性

项 目 曾用名 IL-1α LAF IL-2 TCGF IL-3 Multi-CSF IL-4 BCGF－1 IL-5 TRF IL-6 BSF-2 淋巴细胞、巨噬细胞与来源 成纤维细胞 成纤维细胞 比活(U/mg) 分子质量17.5 （kD） 等电点pI 5.2 7.0, 7.7, 8.5 4.5~8.0 6.3~6.7 4.7~4.9 － 13~16 28 15 18 19~21 1.2×107 1×107 2.5×104 1.9×104 9.6×104 1.7×107 活化T细胞 活化T细胞 活化T细胞 活化T细胞 单核细胞与化学组成 单克隆抗体 单链蛋白 ＋ 单链糖蛋白 ＋ IL－2依赖单链糖蛋白 ＋ IL－3依赖性细胞增殖反应 促进造血干单链糖蛋白 － 抗IgM抗体活化B细胞增殖反应 单链糖蛋白 ＋ 小鼠脾脏B细胞特异IgG检测 单链糖蛋白 － B细胞分泌IgG、IgM检测 胸腺细胞增检测方法 殖反应 反应 促进T与B细胞增殖分激活各种免生物学活性 疫细胞 种细胞毒性，抑制角质细胞生长 进肥大细胞和巨噬细胞和粒细胞增功能 殖分化 胞增殖分化 激造血细胞 化，诱导多性细胞增殖促进T和B细胞和T细细胞增殖，胞增殖，促调节T细胞进嗜酸粒细生长分化促促进B细胞诱导B细胞增殖分化产生Ig，提高NK细胞，刺目前，国内批准上市并在临床上应用的白细胞介素主要有IL－2、IL－6和IL－12三种，其它也已经有部分进入临床研究阶段。其中IL－2是最早批准上市的白细胞介素品种。

人IL－2是一种分泌型蛋白类细胞因子，在分泌出细胞前由153个氨基酸残基组成，在分泌出细胞的过程中，被切除掉一个信号肽（含20个氨基酸残基）后，剩下143个氨基酸残基，成为成熟的IL－2分子，其精确分子质量为15420。不同来源的IL－2分子不同，这种不同首要原因是由于所含糖组分不同引起的。人的IL－2含2个半胱氨酸残基，分别为第第58位、第105倍、第125位。在正常情况下，第58位和105位的两个半胱氨酸之间形成二硫键，第125倍半胱氨酸呈游离状态。如果在某些特殊情况下，第125位半胱氨酸与第58位或第105位半胱氨酸发生错配形成二硫键，则IL－2的生物学活性完全丧失，这说明了正确形成二硫键的重要性。通过基因工程技术手段，将第125位的半胱氨酸置换成丝氨酸或丙氨酸，可显著提高其生物活性和热稳定性。人IL－2与小鼠的只有50%的同源性，与牛有69%的同源性。

IL－2在pH2－9范围内稳定，56℃加热1小时仍有活性，但65℃加热30分钟即失去活性。对各种蛋白酶敏感，对核酸酶不敏感。

在临床上，IL－2用于诱导T细胞增殖与分化，刺激T细胞分泌γ干扰素，增强杀伤细胞的活性，故在调整免疫功能上有重要作用，常用于治疗一些免疫功能不全以及癌症的综合治疗。另外，IL－2对创伤修复也有一定疗效。

（二）基因工程白细胞介素－2的生产工艺过程

基因工程白细胞介素－2使用的宿主菌为大肠杆菌，载体与干扰素生产一样，所含的启动子为温度敏感型。本书省略白细胞介素－2基因工程菌的构建过程，重点介绍白细胞介素－2基因工程菌发酵和产物纯

化的工艺过程。

1． 工艺流程

白细胞介素－2基因工程菌生产的工艺流程图见下图：

图4－8 白细胞介素-2生产工艺流程图

2． 生产过程及工艺控制 （1）发酵

①工程菌种 白细胞介素－2基因工程菌种构建用的是大肠杆菌，编号为JF1125。所用载体为pLY-4，内含温度敏感型启动子PL和氨苄青霉素抗性基因。

②种子制备 种子用摇瓶制备，培养基用LB培养基，培养温度30℃，培养时间10小时。 LB培养基的配方为：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl0.5%。调pH7.4。

③发酵 在15L发酵罐中装料10LM9CA培养基，灭菌后接入摇瓶种子，控制温度30℃发酵10小时。如果要进一步扩大培养，则可以此作为种子转接更大发酵罐，培养条件一样。培养完成后，培养液中的细胞浓度已经达到所需要求，升高培养温度至42℃，诱导3小时左右，发酵就完成了。

（2）分离纯化

① 包涵体制备 工程菌经发酵培养、诱导表达后，离心收集，悬浮于含1mmol/L EDTA的50mmol/L Tris-HCl溶液(pH8.0)中，用超声波破碎菌体3次，用显微镜检查破碎情况。待细胞破碎良好后，8000r/min离心15min，收集沉淀。白细胞介素-2包涵体是不溶性的，经离心后，富集在沉淀中。沉淀中除了白细胞介素-2包涵体外，还有破碎的细胞碎片。

② 包涵体洗涤及裂解 上述制备得到的含大量白细胞介素-2的包涵体沉淀，吸附有部分可溶性蛋白和核酸杂质，可通过洗涤除去。先用10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)洗涤3次，然后8000r/min离心15min收集沉淀，再用4mol/L尿素溶液洗涤2次，同样8000r/min离心15min收集沉淀。最后用含1mmol/L EDTA的50mmol/L Tris-HCl(pH6.8)悬浮沉淀，并向其中加入盐酸胍至终浓度6mol/L，水浴加热至60℃维持15min，并不断搅拌，然后12000r/min离心10分钟，收集上清液即为白细胞介素-2包涵体裂解液。

③ 凝胶过滤及复性 将Sephacryl S-200柱用含0.1mol/L醋酸铵、1%SDS和2mmol/L巯基乙醇的缓冲液(pH7.0)平衡过夜。上柱后，用同一平衡液洗脱，收集白细胞介素-2活性峰组分。再用醋酸铵pH=7.0缓冲液、2mol/L硫酸铜复性，得到白细胞介素-2纯品，纯度高于96%，回收率约为50%。

四、人促红细胞生成素

（一）特性、结构与功能

人促红细胞生成素，英语名称erythropoietin，简称EPO。红细胞是由骨髓中的干细胞分化、增殖，再经爆裂样红细胞生成单元和集落红细胞生成单元，最后作为成熟细胞释放至血液中的。人红细胞生成素（rhEPO）主要作用于集落红细胞生成单元，它可通过与集落红细胞生成单元的rhEPO受体结合而加速该细胞的分化和增殖，促进产生红细胞。20世纪50年代初人们认识到肾脏可以产生一种激素，刺激红细胞生长，称为促红细胞生成素（EPO）。1983年林氏成功地分离及克隆出EPO的基因，并明确该基因位于人类第7对染色体上，含有5个外显子和4个内含子，所表达出的富含涎酸的糖蛋白即EPO。1985年科学家应用人工重组方法合成了EPO，称为人工重组促红细胞生成素（rHu EPO）。至今已对数以百万计各型肾脏病贫血患者进行治疗并取得十分满意的结果。

红细胞生成素是一种糖蛋白，分子量约30～39kD，主要由肾小管内皮细胞合成，也可由肝细胞和巨噬细胞产生。EPO是一种强效的造血生成因子，在0.05～1U/ml时即呈剂量依赖效应。EPO活性单一，只作用于骨髓巨核前体细胞，可刺激红祖细胞及早幼红细胞形成成熟的红细胞集落；对红细胞造血过程的调节需其他细胞因子（如IL-3、GM-CSF和IL-1等）的协同作用才能完成。EPO的产生受机体内血容量和氧分压的调节，在失血或低氧的刺激下，EPO水平迅速上升。在某些肿瘤患者，可也现EPO异常增高；骨髓造血反应不良的贫血患者，其EPO也升高。

按促红细胞生成素来源的差异，目前临床上使用的促红细胞生成素有两类，即天然红细胞生成素和非天然红细胞生成素。

天然红细胞生成素是以人或动物的尿、血等为原料，经生物化学方法纯化得到的红细胞生成素。按种属不同可分为人红细胞生成素、小鼠红细胞生成素、猴红细胞生成素等。目前已知人红细胞生成素以两种形式存在，即人红细胞生成素-α(EPO-α)及人红细胞生成素-β(EPO-β)，二者氨基酸组成及顺序相同，都含有165个氨基酸残基。分子量、等电点及生物活性也都类似，差别在于二者的糖型组成不同，EPO-α含有较多的N-乙酰葡糖胺，总的含糖量也较EPO-β高。

非天然红细胞生成素主要是指重组人红细胞生成素，即以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素的基因连接到表达载体上，用以转化CHO细胞，从细胞的培养上清中纯化得到EPO。重组人红细胞生成素与天然人红细胞生成素具有相同的体内、体外活性，比活则更高些。同天然人红细胞生成素一样，基因工程人红细胞生成素依据糖基结构的差异也可分为α、β两种，即rHEPO-α和 rHEPO-β。

EPO是最早应用于临床的细胞因子，是迄今所知作用最单一、且安全可靠的升血红蛋白制剂。对于肾贫血、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤及阵发性夜间血尿等均有一定疗效；此外，应用EPO还可减少手术中的输血量，并能在一定程度上纠正由恶性肿瘤、化疗及类风湿

性关节炎引起的贫血。由于EPO主要由肾小管内皮细胞产生，肾性疾患引起的贫血是EPO的首选适应证；EPO纠正肾性贫血的疗效几乎是100％，但并不能改善肾功能。另外，EPO使用的有效性与机体的铁储备也有一定关系，在应用EPO后，造血增强，铁利用增强；因此应适当补给一定量的铁。

rhEPO的促红细胞生成作用已得到大量动物实验和临床试验的验证，已获得的适应症主要有：

①肾性贫血

这是rhEPO最早的适应症，几乎所有慢性肾衰贫血患者经数月rhEPO治疗后均能获得很好的疗效。rhEPO给药方案通常为起始剂量100～150IU/kg，每周3次，皮下注射，达到目标值后每月进行25%的剂量调整，2～3个月后使红细胞压积达到33%以上。而随着红细胞压积升高，慢性肾衰患者不仅贫血现象得到纠正，输血需求减少甚至避免，而且生活质量亦出现明显改善，有利于患者康复和继续工作。

②艾滋病患者贫血

艾滋病贫血是由艾滋病病毒直接或间接抑制骨髓干细胞及接受治疗的齐多夫定等逆转录酶抑制剂对骨髓的抑制作用等产生的，rhEPO对这类患者的疗效也较好。

③癌症相关贫血

贫血在癌症患者中普遍存在，大多因rhEPO产生相对减少或反应性降低所致，而化、放疗引起的骨髓抑制则可加重贫血。用rhEPO100～150IU/kg/次，每周3次，皮下注射，4～12周，矫正癌症相关性贫血的有效率为40～70%。癌症患者贫血的矫正不仅可使输血量减少，而且对患者能够持续接受化疗、放疗并提高疗效也有帮助。

（二） 生产工艺

由于天然促红细胞生成素的原料来源受限，现在生产的人促红细胞生成素多由基因工程方法生产，本文以基因工程方法为例，介绍人促红细胞生成素的工艺过程。国内生产EPO均采用CHO工程细胞培养法。CHO为中国仓鼠卵巢细胞。

1．工艺流程

通过CHO工程细胞培养生产rhEPO的工艺过程如下图：

图4－9 rhEPO生产工艺流程图

2． 工艺过程及控制要点

① 细胞复苏 先将含10%小牛血清的DMEM培养基按说明书溶解灭菌后，注入培养板的小孔中。再将冻干保存的细胞取出，接种入培养板的小孔内，于37±0.1℃培养7d左右。这一步相当于微生物发酵过程中的斜面菌种的制备过程。

② 方瓶培养 方瓶培养属于CHO细胞种的扩大培养过程。方瓶的体积一般为几百毫升。内装DMEM培养基，灭菌后接入前述细胞种，培养方法同前。这一步相当于微生物发酵过程中摇瓶种子制备过程。

③ 转瓶培养 转瓶比方瓶要大，常见规格是5L。转瓶培养采用培养基为含有10%小牛血清的DMEM培养基。将经方瓶培养的CHO工程细胞种接种转瓶，在将转瓶置于转瓶机上，维持37±0.1℃培养5－7d后用蛋白酶消化，使贴附的细胞脱落。此类似于微生物发酵种子罐种子制备过程。

④ 微载体培养 微载体培养，亦称为堆积培养，相应的培养设备称之谓堆积培养反应器。动物细胞具有贴壁依赖性，即只有贴在一定的固体基质上，动物细胞才能存活并生长繁殖，因此，在动物细胞培养过程中，必须要为其提供大面积的表面以供贴壁之用。前面的方瓶或转瓶培养，均利用瓶壁作为贴壁基质。这些方瓶或转瓶的比表面积有限，为了提供大的总表面积，必须增加大量的设备，而微载体培养则不同，它利用葡聚糖微小颗粒作为载体材料，一方面，其比表面大，另一方面，细胞贴附于其上后，这些微小颗粒还可继续悬浮在培养基中进行悬浮培养，方便传质。这种即存在贴壁现象，又有悬浮现象的培养方式，也被形象地称为贴壁－悬浮培养或假悬浮培养。产EPO的CHO工程细胞株先经消化，使其自转瓶内壁脱落，然后与葡聚糖微载体混合，在37±0.1℃培养，采用无血清培养基CHOS－SFM II，该培养基已经商品化，可在市场上买到。培养过程中，细胞先分泌一些贴附因子，使自身贴附到微载体表面，再进行生长、繁殖并合成EPO。合成的EPO分泌到培养液中，经过一段时间培养，培养液中的营养水平降低，EPO含量升高后，就可通过反应器上自带的过滤器，将培养液滤出，微载体依然留在反应器中，重新添加新鲜培养基再进行培养。这一过程称为灌流培养，收获的培养液叫灌流液。

⑤ 离子交换层析 一般用体积0.8L的玻璃柱，内填Q-SepharoseXL阴离子交换树脂，在灌流液上柱之前，先用0.1mol/L的磷酸缓冲液平衡。以每柱上样18L的标准，将经冷冻离心除细胞碎片后的灌流液用蠕动泵上柱，流程约为40ml/min。由于EPO表面带有负电荷，经交换，EPO被交换出来。交换完成后，先用20mmol/LNaCl缓冲液洗除部分杂质，再用150mmol/L NaCl洗脱，收集EPO洗脱液。

⑥ 脱盐 将上述离子交换层析收集的EPO洗脱液，经葡聚糖凝胶柱（Sephadex G-25）脱

盐。脱盐前，葡聚糖凝胶柱先用10mmol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡。

⑦ 反相层析 反相层析常用Waters4000 HPLC，选用C4柱。C4柱的固定相载体一般为硅胶，以丁基为键合相。上柱前，先用10mmol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡。一般选择体积为300 mL的C4柱，上柱流速为10mL/min。上样完成后，先用平衡缓冲液淋洗至基线，以10mmolLTris-HCl(pH7.0)缓冲液为A液，无水乙醇为B液，分别用20%、50%、60%B液的不连续梯度洗脱，流速为10mL/min，收集60%B洗脱峰。收集样品用注射用水稀释后，超滤浓缩至50mL。

⑧ 分子筛层析 将上述反相层析后浓缩样品上样于流动相为10mmol/L的柠檬酸钠100 mmol/L NaCl的S-200柱上，上样量小于柱体积的5%，上样及洗脱速度为5mL/min，收集EPO活性峰。S-200为凝胶色谱柱。

⑨冻干与制剂 将上述EPO活性峰经微孔膜过滤后，分装安瓿瓶中冻干制成注射剂。 （三）活性检测

EPO体外活性检测用ELISA检测试剂盒检测；体内则用网织红细胞计数法。详细检测规程请参照《中华人民共和国药典》（2005版）中EPO部分。