EBER检测试剂盒(原位杂交)之欧阳科创编

EBER检测试剂盒（原位杂

交）

时间：2021.02.05 创作：欧阳科 （操作之前请详细阅读此说明书） 检测原理和意义

EBER是EB病毒编码的小RNA，是EB病毒的表达产物，在EB病毒感染的细胞核中以高拷贝数存在。根据EBER的特有序列设计的EBER单链 DNA探针能特异地与EBER靶序列互补、杂交，从而检测EB病毒是否存在。此方法检测石蜡组织切片中的EB病毒具有极高的特异性和灵敏性。目前EBER原位杂交已成为组织和细胞中EB病毒的标准检测方法，在国际上广为使用。

试剂盒提供的材料和试剂

1 2 3 4 5 6 7 8 9 EBER杂交液 蛋白酶K 一抗 二抗 HRP聚合物 DAB底物 DAB 18X18mm盖玻片 湿盒增效液 成 份 保存方法 -20℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃/室温 4℃/室温 提供量 20人份 400ul 40ul 1ml 1ml 1ml 1ml 20ul 20片 30ml 50人份 1.0ml 100ul 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 50ul 50片 30ml （注意：EBER杂交液请-20℃保存）欧阳科创编 2021.02.05

欧阳科创编 2021.02.05

用户自备材料和试剂

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

55℃恒温培养箱 37℃恒温培养箱 光学显微镜 移液器 计时器

玻片染色缸和染色架 湿盒2个

8. 9. 10. 11. 12. 13.

二甲苯 酒精

PBS(pH=7.6) 苏木素 氨水 盐酸酒精

 实验前需配试剂 30％湿盒增效液

取湿盒增效液及蒸馏水，按3:7配制成30%湿盒增效液备用。  实验时需配试剂 A、1X蛋白酶K

将蛋白酶K与1×PBS按1：25的比例配制备用。（现配现用）

B、DAB显色液

依据需要配制DAB显色液，以可覆盖整个组织的量为宜。取DAB与DAB底物，按照1：50的比例混匀，避光保存备用。(现配现用) 操作步骤

1．切片处理：将4um厚度的组织粘附在APES处理的载玻片上，切片于60-70℃烘烤60分钟以上。（建议每次实验同时附加阳性、阴性对照片） 2．脱蜡及水化：

（过应蜡证注的相时脱白酶K消3．蛋

化：甩干切片, 将组织周围液体用滤纸吸干, 每张切片滴加适量1×蛋白酶K工作液(约50 ul，根据组织大小增、减量), 室温孵育5分钟。蒸馏水洗涤1×1分钟，小心擦干组织周围液体。 4．杂交：

4.1 每张切片滴加适量杂交液(约20 ul，根据组织大小增、减量)，并加盖玻片（本试剂盒配备，可溶液 二甲苯 100%酒精 95％酒精 80%酒精 蒸馏水 次数×时间（分）

3×10 1 ×3 1 x 3 1 ×3 1 x 3

意：使用二甲苯，应延长脱间，以保蜡完全）

根据加入杂交液量进行剪裁）；

4.2 放置水湿盒中，55℃恒温箱孵育60-90分钟；

4.3 转至37℃孵育4-16 小时（放置于30%湿盒增效液湿盒中）。建议过夜（＜16小时）以保证低

拷贝样本的杂交效果；

4.4 48℃（PBS 预温）浸泡切片，小心移去盖玻片，继续浸泡5分钟； 4.5 48℃PBS洗涤3x 5分钟 (轻微振荡容器)；

（注意：盖玻片规格应与杂交液量匹配，切片在整个试验过程中要保持湿润状态，防止干片）

5．信号放大与显色：

5.1 小心擦去组织周围液体，滴加适量一抗(约50 ul，根据组织大小增、减量)，37℃，水湿盒中孵

育30分钟；37℃PBS浸泡3x2分钟（轻微振荡容器）；

5.2 小心擦去组织周围液体，滴加适量二抗(约50 ul，根据组织大小增、减量)，室温，水湿盒中孵育

20分钟；室温PBS浸泡3x2分钟(轻微振荡容器)；

欧阳科创编 2021.02.05

欧阳科创编 2021.02.05

5.3 小心擦去组织周围液体，滴加适量HRP聚合物(约50 ul，根据组织大小增、减量)，室温，水湿

盒中孵育30分钟；室温PBS浸泡3x2分钟 (轻微振荡容器)。

5.4 小心擦去组织周围液体，滴加适量DAB显色液(约50 ul，根据组织大小增、减量)，室温，水湿

盒中孵育约10分钟（不同样本的显色时间可能有所差别，建议镜下观察显色过程）；室温PBS浸泡3x2分钟(轻微振荡容器)。

5.5 自来水冲洗，苏木精复染（可用盐酸酒精分化及氨水返蓝）。梯度酒精脱水，中性树胶封片。 阳性结果判断标准：仅为细胞核着色。胞浆和胞膜着色不能视为阳性，只有当核分裂时可以出现胞浆阳性着色。

其他事项：

本试剂保质期为12个月。客户在收到产品时请及时检查，如发现有外包装破损、试剂盒成分不全等产品问题，或者在使用过程中有任何疑问，请及时与泰普客户服务中心联系，我们将及时为您解决。

公司信息：

公司名称：福建泰普生物科学有限公司

总部：福建省福州市金山金洲北路7号金山科技企业孵化器7号楼4层 邮编：350002 电话：800-804-8333，0591-2805 3600 传真：0591-2805 3700

研发中心：北京市昌平区北清路中关村生命科学园创新大厦A座207室 邮编：102206 电

话

：

010-8072

0071

传

真

：

010-8072

0072

欧阳科创编 2021.02.05

欧阳科创编 2021.02.05

操作步骤简表 操 作 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 二甲苯 100%酒精 95%酒精 80%酒精 蒸馏水 酶消化 蒸馏水 加杂交液 55℃变性 30％湿盒增效液的湿盒中孵育 PBS（用前48℃预温）脱片＋浸泡 PBS（用前48℃预温）浸泡 加一抗 PBS（37℃）浸泡冲洗 加二抗 PBS浸泡冲洗 HRP聚合物 PBS浸泡冲洗 DAB显色 PBS浸泡 自来水冲洗 复染，脱水，封片 参 数 3X10’ 1X3’ 1X3’ 1X3’ 1X3’ 室温,5’ 1’ 适量 60’-90’ 37℃，4-16h 1-5’+5’ 3X5’ 37℃，30’ 3X2’ 室温，20’ 3X2’ 室温，30’ 3X2’ 室温，2-10' 3X2’ 1’ 常规 时间：2021.02.05 创作：欧阳科 欧阳科创编 2021.02.05