基因工程知识点总结

基因工程的诞生Berg构建第一个重组体及Cohen构建第一个有功能重组体两个经典实验的巧妙设计、以及基因工程的基本特点。基因工程的基本定义对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。广义基因工程：DNA重组技术的产业化设计与应用。分为上游和下游技术。上游技术：外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（狭义基因工程）下游技术：含有外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。基因工程又称为：genemanipulation,genecloning,recombinantDNAtechnoglogy,geneticmodification,newgenetics,molecularagriculture重组DNA技术、基因工程的基本过程1）材料的准备：目的基因、载体、工具酶和受体细胞（宿主）的准备。用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。2）目的基因与载体DNA的体外重组，形成重组DNA分子。3）重组的DNA分子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系。4）筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表达。进一步可将基本步骤概括为：切、接、转、增、检［步骤演示］基因工程的基本原理：主体战略思想是外源基因的高效表达，可从四方面达到目的：1）利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高宏观表达水平。2）筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件：启动子、增强子、上游调控序列、操作子、终止子。3）修饰和构建蛋白质生物合成的翻译调控元件：序列、密码子。4）工程菌（微型生物反应器）的稳定生产及增殖。1.理论上的三大发现：证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）DNA的双螺旋结构和半保留复制机理遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立2.技术上的发现DNA分子的体外切割与连接技术DNA分子的核苷酸序列分析技术外源DNA对感受态的大肠杆菌细胞的转化技术琼脂糖凝胶电泳测序技术质粒DNA的提取原理：是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。当pH≥12.6时，染色体DNA与质粒DNA的变性，当pH＝7时，质粒DNA复性，溶解在溶液中的染色体DNA不能迅速复性，形成缠连的网状结构，离心后沉淀下来.碱抽提法所用各类试剂的生化作用溶菌酶：是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1.4糖苷键。葡萄糖：增加溶液的黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力而降解.EDTA(乙二胺四乙酸二钠)：螯合Mg2+等，抑制DNase对DNA的降解.同时溶菌酶需较低的离子浓度.NaOH：使溶液的pH≥12.6.SDS：可以溶解细胞壁上的脂质和蛋白质，解聚核蛋白，并与蛋白质形成复合物而沉淀.NaAC：实际是NaAC-HAC的缓冲夜pH=4.8使溶液pH由12.6降至7.0乙醇：无水乙醇可沉淀DNA，乙醇可与水以任意比例互溶，DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇后，乙醇会夺去DNA周围的水分子使DNA失水易于聚合.NaAC.NaCL：当PH=8时，DNA分子带负电荷，Na+可中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子间的斥力.75％乙醇：洗涤除去残留的盐和有机物.RNase：降解RNA.TE缓冲液：由Tris-HCL和EDTA构成的缓冲系统，使系统内环境保持在生理范围内.酚-氯仿：抽提蛋白质.酚和氯仿是有机溶剂，更易与蛋白质互溶，蛋白质之间的水分子被酚-氯仿挤去，使蛋白质失水而变性，离心后，水相居上，蛋白质沉淀居中，酚-氯仿留在底层.异戊醇：能降低分子表面张力，减少气泡，因气泡会阻止分子间相互作用.饱和酚：酚与水有一定的互溶，用水饱和酚后，在抽提DNA过程中，使酚不致吸收样品中含DNA的水分，减少DNA的损失.DNA的定量和纯度测定（1）方法：①紫外光谱分析、②荧光分析、③水平式琼脂糖凝胶电泳法、④聚丙烯酰胺凝胶电泳法、⑤脉冲电泳法（2）紫外光谱分析原理：DNA(RNA)在260nm处有特异的紫外吸收峰，并且吸收强度与系统中的DNA或RNA的浓度成正比。[dsDNA]＝50×OD260×稀释倍数(ug/ml)[ssDNA]or[ssRNA]＝40×OD260×稀释倍数(ug/ml)纯度：OD260/OD280＝1.8,DNA；OD260/OD280﹥1.8,DNA被RNA污染；OD260/OD280﹤1.8，DNA被蛋白质污染；OD260/OD280﹤0.9,需重新抽提除去蛋白质；OD260/OD280﹥2，需重新抽提除去RNA；特点：能测浓度和纯度，准确，简便，但需较贵重的仪器紫外分光光度计。（3）EB荧光分析原理：EB(溴化乙锭)，一种焚光染料，它能插入DNA或RNA的碱基对平面之间而结合于其上。一旦EB结合在DNA分子上，它能在紫外光的激发下产生桔黄色荧光。由于结合于DNA分子之上的EB的量与DNA分子长度和数量成正比，则荧光强度可以表示DNA量的多少。步骤：将标准的DNA溶液按浓度由低到高分别与同样体积的EB溶液混匀在一块黑色的点样板上形成一个浓度梯度，然后将待测DNA也与同样体积的溴化乙锭混匀，将待测样品与标准品，在紫外灯下比较发出的荧光强度，就能测出该样品总DNA浓度。特点：简便易行、经济，缺点是准确性较低。电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳过程必须在一种支持介质中进行，以琼脂糖凝胶为介质的电泳称为琼脂糖凝胶电泳（Agarosegelelectrophoresis），它主要用于核酸分子量大小的检测和核酸分子的分离纯化；以聚丙烯酰胺凝胶为介质的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质主要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析、纯化。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，它主要用于分离、鉴定和纯化DNA片段。琼脂糖是从海藻中分离的多糖，由D-半乳糖与L-半乳糖通过糖苷健交替构成的线性多聚物，呈白色粉末状。该物质制成胶体后，胶内形成网格状孔隙，作为电泳的支撑介质使核酸分子在其间穿行。在生理条件下，核酸分子的磷酸基团以带负电的离子化状态存在。因此，当核酸分子被放置在电场当中的琼脂糖凝胶介质内时，它们就会沿着胶内的网格状孔隙向正电极的方向迁移。由于糖–磷酸骨架在结构上的重复性质，大小相等的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们向正电极方向迁移的速度也相同。因此，在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，与DNA分子中的碱基组成和顺序无关。分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子泳动的速度快，迁移距离远。具有较紧密构型的DNA分子，其电泳迁移率比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。这样含有不同大小和构型核酸的样品上样于凝胶后，电流通过凝胶，样品就以不连续的条带在凝胶上一起朝正极方向泳动。因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异，以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是最常用来分离蛋白质的凝胶系统，也用于低分子量DNA片段的分离。PAG电泳有静电效应和分子筛效应，分辨力很高。在DNA顺序分析时，即使相差一个核苷酸的片段也能很好的分开。PAG是由丙烯酰胺(acr)和交联剂N1N’一甲叉双丙烯酰胺(bis)，在催化剂N，N，N，N’一四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸胺(AP)存在下聚合成网格状凝胶。凝胶的孔径与丙烯酰胺的浓度及丙烯酰胺与双丙烯酰胺比例相关。电泳之前蛋白质都要用十二烷基硫酸钠(SDS)处理。SDS会结合在蛋白质上，每一条布满SDS的蛋白质具有相似的电荷—分子量比值。并将蛋白质的多条链分开。这样，在电泳中，SDS—蛋白质链就基本根据分子量的大小分开。一般10％浓度的聚丙稀酰胺凝胶电泳可分离分子量20一200KDa的蛋白质。核酸分子杂交是指具有同源序列的单链DNA或RNA分子，可依照碱基互补的原则形成双链的过程。它是根据双链DNA分子在一定条件下能够变性和复性的原理，由RoyBritten及其同事于1968年创建的。核酸分子杂交的根本目的是为了检测出同源DNA序列，因此，在鉴别重组子、分离基因、分析DNA片段、研究表达等工作中都涉及核酸杂交，现已成为分子克隆的核心技术之一。核酸分子杂交技术主要有Southern印迹杂交、Northem印迹杂交和菌落（噬菌班）原位杂交等。Southernblot：构建DNA分子的遗传图，或进行目的基因的序列测定都必须知道DNA分子中基因编码区的大小和位置。而这类数据资料则要应用Southern印迹杂交技术才能获得。带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA分子，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将通过碱基配对而退火形成双链的结构。Southern依据此原理设计了独特的DNA转移技术。利用毛细管作用，将凝胶上变性的DNA片段原位吸引到支持介质硝酸纤维素滤膜上，并使其固定，然后让探针与之相遇并杂交。最后利用探针携带的放射性信号，对实验结果作出判断。Southernblot步骤：DNA片段的分离、DNA片段的转移、DNA片段的固定、DNA片段与探针杂交、放射自显影。杂交的主要目的是为了检测出同源DNA序列，而为了达到这一目的，就必须要有标记的探针。所谓核酸分子探针(NucleicAcidMolecularProbe)，是指带有能检测的标记物的单链DNA或RNA分子，且该分子能与目的核酸序列进行退火杂交。那么，使DNA或RNA分子带有可检测的标记物的过程就叫探计标记。虽然探针的种类较多，标记探针的方法也多种多样，但最终的目的都是使探针的核苷酸带上可检测的标记物。探针的种类：①基因组DNA探针②特异性cDNA探针③人工合成的寡核苷酸探针。探针标记物：常见的放射性同位素有32P、3H、35S、l4C、125I等。②非放射性标记物一般分子杂交的探针常规采用切口平移法（nicktranslationlabeling）和随机引物法（randomprimedDNAlabeling）进行标记。Northernblot是检测RNA（主要是mRNA）的方法，与Southern杂交的不同，它的靶核酸是RNA，进行RNA电泳，转膜时不需变性。原位杂交：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。PCR基本技术的原理利用PCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应，是通过3个温度依赖性步骤完成的反复循环。反应共分3步进行：（1）变性(denaturation)，即双链DNA在94℃下通过热变性使其双链间氢键断裂而解离成单链。（2）退火(annealling)，即当变性温度突然降至引物Tm值以下时，引物与模板DNA互补序列杂交。由于模板DNA分子结构远复杂于引物结构，且反应体系中引物DNA分子的摩尔数远大于模板DNA，故在退火温度下引物与模板DNA分子可形成互补的杂交链，而单链模板DNA间互补形成双链的机会要少的多。（3）延伸(extension)，即在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸、底物及Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶依赖其5′→3′的聚合酶活力，以引物为起始，互补的DNA链为模板，使引物序列得以延伸，形成模板DNA的互补链。经过高温变性、低温退火、中温延伸3个温度的循环，模板上介于两引物之间的片段不断扩增(图1)，目的片段以2n形式得到积累，经25-30个循环后目的片段的DNA量即可达到106倍。经PCR扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板DNA间结合的特异性，而PCR产物的大小则取决于两引物退火位点5’端之间的距离。PCR反应体系：（1）DNA模板（2）引物（3）脱氧核苷三磷酸（4）耐热性聚合酶（5）PCR反应的缓冲液平台效应：经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。与下列因素有关：1）引物、dNTP的浓度降低，掺入速度减慢；2）随产物增加，酶与模板的比例下降；3）非特异性产物或引物二聚体与反应物的竞争；4）产物的再结合。DNA序列分析是一项测定DNA分子中核苷酸组成及排列顺序的技术。目前测序技术主要有化学降解法和双脱氧链终止法，它们在原理上差异很大，但是目的是一致的。根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在变性的PAGE胶上电泳检测，从而获得DNA序列。Sanger双脱氧链终止法的原理双脱氧核苷酸是一种经化学修饰的分子，它在糖基的2’-碳原子和3’-碳原子上都缺少一个羟基[图5.1(a)]，而正常的脱氧核苷酸在糖基上有一个3’-羟基。DNA复制过程中，天然核苷三磷酸，通过与模板链的核苷酸配对，5’-α-磷酸基与生长链最后一个核苷酸的3’-羟基相连。如果是双脱氧核苷酸结合在生长链的末端，DNA合成就会终止，因为这样就不能与下一个核苷酸形成磷酸二酯键。Sanger就是利用这一典型特征设计了双脱氧链终止法。DNA聚合酶能够利用待测单链DNA作模板，合成出对应的DNA互补链，但在反应过程中，如果2’，3’双脱氧核糖核苷三磷酸底物掺入到寡核苷酸链的3’端，DNA链的延伸反应即被终止。在4个特定反应体系中分别加入一种ddNTP反应底物(ddCTP、ddATP、ddGTP、ddTTP)以及DNA模板、合成引物、DNA聚合酶I、一定浓度的dNTP((dCTP、dATP、dGTP、dTTP，其中有一种是带32P放射性标记的，dNTP/ddNTP=1/3~1/4左右)，使DNA链的合成随机终止于某—特定ddNTP。每个反应体系中都合成出一系列不同长度的DNA片段混合物。它们都具有同样的5`-末端，并在3`-末端的ddNTP处终止。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影技术读出DNA的碱基序列。应该注意的是，在胶片上所读的碱基序列为待测DNA模板的互补序列。由于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果的制约，一次测序反应大约只能读出300-350个核苷酸。化学降解法末端放射性标记的DNA单链，经化学试剂处理，特定的碱基引入化学集团，DNA在被修饰的核苷酸位置断裂，长度只差一个核苷酸的DNA链混合物，进行凝胶电泳，放射性自显影，阅读碱基顺序。杂交测序法的原理（1）只有完全互补的DNA序列才能杂交形成完全的双链分子。杂交效率最高。（2）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。（3）非互补碱基越多，杂交效率越差。（4）用一段寡居聚苷酸（8-mer）的所有可能的碱基排列序列作探针。8mer探针有48=65536种序列。（5）根据杂交效率可推断出靶DNA的序列。12mer靶DNA与8-mer探针杂交，将会有5种探针与之形成完全互补双链。自动测序法的工作原理以荧光剂如四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）等，预先标记M13引物DNA（荧光剂在激光的激发下能产生荧光），然后按Sanger双脱氧链终止法进行反应，反应产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大小不同的DNA片段，在电泳的同时读取碱基序列。具体做法是，让激光柱照射电泳凝胶底部的一个固定位置，在凝胶上方安装一套荧光信号接受系统。电泳时，当被荧光剂标记的DNA片段经过激光柱时，在激光的激发下产生荧光，荧光信号接受系统把它转换成电信号输送给计算机处理系统，处理后可直接打印出DNA的序列。总的来说，自动测序系统每次能够以高精度测读大约500个碱基。酵母双杂交系统是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和转录激活结构域（activationdomain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。一种识别稳定结合于DNA上蛋白质的有效工具，不仅可在酵母细胞内研究DNA与蛋白质的互作，还可通过筛选cDNA文库直接得到DNA靶序列互作蛋白质的cDNA序列。靶DNA序列特异的结合蛋白（BDPX）与GAL4的激活结构域可融合形成融合体，BDPX可与其在DNA上的特异结合位点互作，激活报告基因的表达。能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。凝胶阻滞试验用来研究DNA与特异性蛋白的相互作用。放射性标记的DNA片段与纯化蛋白，或提取物中的蛋白混合物相结合，然后在非变性凝胶中分析该产物。与游离DNA相比，蛋白-DNA复合物的迁移率将降低，因此，与游离DNA相对应，人们将观察到带中的“阻滞”。DnaseⅠ足迹试验可以精确鉴定DNA结合蛋白（如转录调控蛋白）在DNA分子上的结合位点。不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。凝胶阻滞实验可以确定转录因子是否与DNA直接结合，而DNaseⅠ足迹分析实验则可以精确鉴定其结合的DNA序列，从而帮助我们研究基因转录调控的机制。需要使用同位素（或荧光标记）进行标记，并在反应完成后通过DNA测序胶电泳来进行检测。DNA与蛋白质互作的免疫沉淀分析研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来。限制性内切酶(restrictionenzyme)限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。在限制修饰系统中限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。核酸内切限制酶的类型目前已经鉴定出有三种不同类型的核酸内切限制酶，即I型酶、II型酶和III型酶。核酸内切限制酶的命名法由于发现了大量的限制酶，所以需要有一个统一的命名法。H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者所接受。他们建议的命名原则包括如下几点：①用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠杆菌(Escherichiacoli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)用Hin表示。②用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如Ecok。③如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。④所有的限制酶，除了总的名称核酸内切限制酶R外，还带有系统的名称，例如核酸内切酶R．HindIII。同样地，修饰酶则在它的系统名称之前加上甲基化酶M的名称。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M.HindIII。Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4~8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别序列又称为核酸内切限制酶的切割位点或靶序列。有些识别序列是连续的(如GATC)，有些识别序列则是间断的(如GANTC)，N是代表任意一种核苷酸碱基，切割位点的一个共同特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈回文结构。同裂酶(isoschizomers)有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶(isoschizomers)。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。例如，限制酶HpaⅡ和MspI是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。同尾酶(isocaudamer)与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端，特称为同尾酶。常用的BamHI，BclI，BglII，XhoI就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由-GATC-4个核苷酸组成的粘性末端，很显然，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”(hybridsite)。但必须指出，这类杂种位点的结构，一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。例如：SalI（5′-GTCGAC-3′）和XhoI(5′-CTCGAG-3′)的消化片段相连，但所形成的重组片段（5′-GTCGAG-3′）则不能被上述2种酶的任一种酶识别和切割。但也有例外。DNA连接酶的发现1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(1igase)。这种酶需要在一条DNA链的3′–末端具有一个游离的羟基(–OH)，和在另一条DNA链的5′–末端具有一个磷酸基团(–P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用。同时，由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能的反应，因此还需要有一种能源分子的存在才能实现这种连接反应。在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应，是利用NAD＋

[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]作能源的；而在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP[腺苷三磷酸]作能源。值得注意的一点是，DNA连接酶并不能够连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的ＤＮＡ链必须是双螺旋的一部分。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(nick)，即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂；而不能封闭裂口(gap)，即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。DNA连接酶的种类一种是由大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶：另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4DNA连接酶。连接酶连接缺口DNA的最佳反应温度是37℃。但是在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此，连接粘性末端的最佳温度，应是界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为4-16℃比较合适．主要内容：1.克隆载体2.表达载体3.穿梭载体质粒（plasimd）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。质粒的类型在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒和非接合型质粒。接合型质粒又叫自我转移型质粒。这种质粒不符合基因工程的安全要求。非接合型质粒虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。这种质粒符合基因工程的安全要求。质粒的复制类型一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制（stringentcontrol）型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝；另一类是松弛控制（relaxedcontrol）型质粒，其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。质粒载体的构建天然质粒的局限性：（1）分子量大，拷贝数低，第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长9.1kb。（2）筛选标志不理想，ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。噬菌体载体利用λ噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。①设计去除λDNA上的一些限制性酶切点。这是因为λDNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。②在中段非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝白筛选lacI-lacZ’序列，和多克隆位点等。③由此可构建出两类λ噬菌体作载体；一类是插入型载体，可将外来序列插中段，常用的λgt系列载体，一般容许插入5-7kb外来DNA；另一类是置换型载体，即可用外来DNA替代中段，如IMBL系列载体。插入或置换中段外来的DNA长度是有一定限制的，当噬菌体DNA长度大于野生型λ噬菌体基因组105%或小于78%时，包装而成的噬菌体存活力显著下降。所以λ噬菌体载体可插入长5-20kb的外来DNA，这比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。但λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。黏粒载体/柯斯质粒载体：(cosmid,cossitecarryingplasmid)由λ噬菌体的cos序列与质粒构成的特殊类型的载体。特点：具有λ噬菌体的特性，可在体外包装后，高效转染寄主细胞。具有质粒载体的特性，可在寄主细胞内自主复制。具有高容量的克隆能力，克隆45kb外源基因。柯斯质粒载体的结构特征：1.是环型双链DNA分子,能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb--6kb）载体。用于构建基因组文库.2.具有质粒载体的复制原点，抗药基因，多克隆位点.3.具有λcos位点，可被A蛋白酶切开，提供体外包装的cos末端。人工染色体克隆载体：实际上是一种“穿梭”克隆载体．含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)质粒复制起始位点(ori)和选择标记基因，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。人工染色体克隆载体能容纳1000-3000kb的外源DNA片段.目前有酵母人工染色体克隆载体（YAC）、细菌人工染色体克隆载体（BAC）、人类人工染色体克隆载体（HAC）和哺乳动物人工染色体克隆载体（MAC）。类型：质粒表达载体、病毒表达载体、人工染色体和可转移表达载体。在克隆载体的基础上，组装上启动子、转录终止子和核糖体结合位点等表达元件而构建成的。原核表达载体表达方式1）组成型表达：在启动子的驱动下，外源基因源源不断地表达。（产物产量高，但不适合表达一些对宿主细胞有害的蛋白，T7噬菌体启动子）2）诱导型表达：lac及tac启动子都是IPTG诱导型启动子，trp是色氨酸诱导型启动子，lPL的表达受温度调控。可控性表达，避免表达产物对宿主前期生长的不利影响，又可减少基因表达产物遭受蛋白酶的降解作用，更适合有毒蛋白的表达。3）融合型表达：多克隆位点上有一段融合表达标签，表达为融合蛋白，方便后续的蛋白分离纯化或检测。常见的融合表达标签GST标签或His标签。4）分泌型表达：在起始密码子和目的基因之间加入一个信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内过度积累而影响细胞的生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶性的，不需要复性。植物基因克隆的载体——Ti质粒：存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农癌杆菌中。这种肿瘤的形成是由Ti质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质粒(tumorinducingplasmid)，简称Ti质粒。T-DNA是Ti质粒的核心区段。(2)Ti质粒的作用和改造：1）保留T-DNA的转移功能；2）取消T-DNA的致瘤性，使之进入植物细胞后不至于干扰细胞的正常生长和分化，转化体可再生植株；3）通过简便的手段可使外源DNA插入T-DNA之中，并随着T-DNA整合到植物染色体上。穿梭载体(Shuttlevector)是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在E.coli中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。1.大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体是典型的穿梭载体，其作用主要是将目标基因转移到芽胞杆菌或球菌中去。2.大肠杆菌/酵母菌穿梭载体酵母菌除了在真核生物的细胞生物学研究方面发挥重要作用外，在作为蛋白质的真核表达系统方面也显示出巨大威力。大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体，含有分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与选择标记，另有一个多克隆位点区。由于此类型的载体既可在大肠杆菌细胞中复制，也可在酿酒酵母细胞中复制，因此在遗传学研究中很受欢迎。它使研究工作者可自如的在两种不同的寄主细胞之间来回转移基因，并单独或同时在两种宿主细胞中研究目的基因的表达活性及其它的调节功能。3.其它穿梭载体在哺乳动物、植物、昆虫细胞等细胞中使用的表达载体或其它载体，一般都有在大肠杆菌中复制的元件，因此都具备穿梭载体的特征。基因文库(genelibrary)则是指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落(或噬菌斑)(或成活细胞)即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。在很多情况下目的基因的分离都离不开基因文库。此外基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。基因文库构建包括以下基本程序：①DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。②载体的选择及制备。③DNA片段或cDNA与载体连接。④重组体转化宿主细胞。⑤转化细胞的筛选。当获得了含重组体的宿主细胞时，即完成了基因的克隆。基因的克隆只是分离基因的基础，基因克隆后还要对克隆的基因进行分离，即利用各种手段把目的基因从文库中分离出来。分离出目的基因还必须对其进行必要的检测与分析：如进行序列测定，体外转录及翻译、功能互补实验等。通过这些实验确定出基因的结构及功能。到这时才能算分离到了目的基因。所以，基因的克隆、克隆基因的分离、分离基因的鉴定是利用基因文库技术分离目的基因的主要内容。随机文库克隆数目随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数相等。对于随机文库:N：克隆数目P：设定的概率值(如：0.99，表示在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0.99)x：插入片段平均大小(15~20kb)y：基因组的大小(以kb计)如果插入片段平均大小为20kb，某基因组大小为4×108bp，P=0.99时，根据上式N=1×105。含1×l05个克隆的基因文库相当覆盖了5倍的基因组，在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0.99。随机片段可通过机械切割或限制酶消化产生。机械切割法可获得较均一的随机片段，但片段不能直接用于克隆，需经末端修饰、甲基化，连上接头后再用限制性内切酶消化产生黏性末端。用限制酶消化的方法虽然可直接产生黏性末端，但片段的随机性较差，所以采用后种方法时，文库的克隆数目应大于计算值。cDNA文库是指某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。基因组文库根据DNA来源又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。基因组文库与cDNA文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。文库构建时的信息供体是某一时空条件下的细胞总mRNA，它是在转录水平上反映该生物在某一特定发育时期，某一特定组织(或器官)在某种环境条件下的基因表达情况，并不能包括该生物有机体的全部基因。在某种意义上讲它可以表现基因组的功能信息。再者，cDNA文库只反映mRNA的分子结构。cDNA中不含有真核基因的间隔序列及调控区，确切说cDNA并不是真正意义上的基因。基因组文库构建时遗传信息供体是基因组DNA，因而无发育时期及组织器官特异性，在一个完全的基因组文库中包含着基因组DNA上的所有编码区及非编码区序列的克隆。生物有机体的每一个基因在文库中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列，所以基因组文库可真实地显示基因组的全部结构信息。目前这两类基因文库在基因工程中都得到有效应用。选择哪一种，主要是根据实验目的。在分离RNA病毒基因，研究功能蛋白序列，分离特定发育阶段或特定组织特异表达的基因时应构建cDNA文库。在研究mRNA分子中不存在的序列及基因组作图时必须构建核基因组文库。相同的黏性末端连接同一种内切酶消化时，可产生相同黏性末端。结果：目的基因的正反向插入、载体或目的基因片段会自身环化、载体与单个或多个目的基因片段之间重组等，其中载体的自身环化最为常见。同尾酶：同尾酶连接后，不能用任何一种酶酶切，称为“焊死”。一般采用提高连接反应体系中目的基因对载体的比例，或用碱性磷酸酶对载体进行脱磷酸处理，以阻止线性载体DNA分子自身环化。定向克隆：用两种限制性内切酶消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接。不同粘性末端的连接突出5'末端：Klenow补平，或S1核酸酶切平，然后平头连接突出3'末端：T4-DNApol切平，然后平头连接突出末端不同：Klenow补平，或S1核酸酶切平连接后，可能恢复限制性位点，甚至还可能产生新的位点。XbaI与HindIII（XbaI恢复），XbaI与EcoRI（均保留），BamHI与BglII（产生ClaI位点）平末端DNA片段的连接不具有粘性末端的DNA分子也可以被连接起来。连接这种平末端DNA分子的方法有4种，（1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用衔接物连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法。将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化、转染、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。转染和转化主要适用于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。转化(transformation)，严格地说是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程，而转染一词(transfection)，则是专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。但从本质上讲，两者并没有什么根本的差别。无论转化还是转染，其关键的因素都是用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高膜的通透性，从而使外源DNA分子能够容易地进入细胞内部。细菌转化(或转染)的具体操作程序是：例如：用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞的简单方案是Cohen等(1972)所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA产生5×106~2×107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。植物细胞的转化(1)叶盘法植物细胞转化常用的方法为叶盘法。叶盘法是一种简单易行的植物细胞转化、选择与再生的方法。具体做法是：先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒，再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘。为了对叶盘进行接种处理，需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min，然后用滤纸吸干，放在看护培养基上进行培养，需将叶子背面接触培养基。所谓看护培养基为特定的固体培养基上均匀分布一层胡萝卜细胞或其他细胞的悬浮液，然后覆盖一层滤纸即成。叶盘在看护培养基上培养两天后，转移到含有适当抗生素的选择培养基上进行培养，经过数周后，叶盘周围会长出愈伤组织并分化出幼苗。对这些幼苗的进一步检测(如测胭脂碱，用Southern印迹法、Northern印迹法、免疫分析法等)可以确定它们是否含外源基因以及外源基因的表达情况。（2）电击法电击法(electroporation)的原理是，在很强的电压下，细胞膜会出现电穿孔现象。经过一段时间后，细胞膜上的小孔会封闭，恢复细胞膜原有特性。(3)基因枪法又称高速微型子弹射击法，它是将DNA吸附在由钨制作的微型子弹(直径约为1.2um)表面，通过特制的手枪，将子弹高速射人完整的细胞和组织内。酵母的转化(1)利用酵母的原生质球进行转化：首先，酶解酵母细胞壁，产生原生质球，再将原生质球置于DNA、CaCl2和多聚醇(如聚乙二醇)中，多聚醇可使细胞壁具有穿透性，并允许DNA进入。然后使原生质球悬浮于琼脂中，并使其再生新的细胞壁。(2)利用Li+盐进行转化：这种方法不需要消化酵母的细胞壁，产生原生质球，而是将整个细胞暴露在Li+盐(如0.1mol/LLiCl)中一段时间，再与DNA混合，经过一定处理后，加40％PEG4000，然后经热应激等步骤，即可获得转化体。转化体的选择可以通过在合适的琼脂培养基上平板培养细胞，不需要从琼脂中去收集它们。这种方法的主要缺点是，如果用自主复制的质粒进行转化，转化体的数目比用原生质球低10-100倍。在基因工程中使用的所有的载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特征。质粒以及柯斯载体具有抗药性标记或营养标记，而对于噬菌体来说，噬菌斑的形成则是它们的自我选择特征。根据载体分子所提供的遗传特征进行选择，是获得重组体DNA分子群体的必不可少的条件之一。正如已经叙述过的，这种遗传选择法能将重组体的DNA分子同非重组体的亲本载体分子区别开来。抗药性标记的插入失活作用，或者是诸如β–半乳糖苷酶基因一类的显色反应，便是属于这种依据载体编码的遗传特性选择重组体分子的典型方法。(1)抗药性标记插入失活选择法pBR322质粒是DNA分子克隆中最常用的一种载体分子。编码有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。只要将转化的细胞培养在含有四环素或氨苄青霉素的生长培养基中，便可以容易地检测出获得了此种质粒的转化子细胞。检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插入失活效应(insertionalinactivation)。在pBR322质粒的DNA序列上，有许多种不同的限制性核酸内切酶的识别位点都可以接受外源DNA的插入。例如：在tetr基因内有BamHI和SalI两种限制性酶的单一识别位点，在这两个识别位点中的任何插入作用，都会导致tetr基因出现功能性失活，于是形成的重组质粒都将具有AmprTets的表型。如果野生型的细胞(AmpsTets)用被BamHI或SalI切割过的、并同外源DNA限制性片段退火的pBR322转化，然后涂布在含有氨苄青霉素的琼脂平板上，那么存活的Ampr菌落就必定是已经获得了这种重组体质粒的转化子克隆。接着进一步检测这些菌落对四环素的敏感性。(2)β–半乳糖苷酶显色反应选择法应用这样的载体系列，外源DNA插入到它的lacZ基因上所造成的β–半乳糖苷酶失活效应，可以通过大肠杆菌转化子菌落在X-gal-IPTG培养基中的颜色变化直接观察出来。β–半乳糖苷酶会把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。将pUC质粒转化的细胞培养在补加有X-gal和乳糖诱导物IPTG的培养基中时，由于基因内互补作用形成的有功能的半乳糖苷酶，会把培养基中无色的X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-靛蓝(5-bromo-4-chloro-indigo)，使菌落呈现出蓝色反应。在pUC质粒载体lacZ序列中，含有一系列不同限制酶的单一识别位点，其中任何一个位点插入了外源克隆DNA片段，都会阻断读码结构，使其编码的肽失去活性，结果产生出白色的菌落。因此，根据这种β–半乳糖苷酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA插入序列的重组体克隆。重组DNA分子转化到大肠杆菌寄主细胞之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能的表达，那么分离带有此种基因的克隆，最简便的途径便是根据表型特征的直接选择法。这种选择法依据的基本原理是，转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。例如，编码大肠杆菌生物合成基因的克隆所具有的外源DNA片段，对于大肠杆菌寄主菌株的不可逆的营养缺陷突变具有互补的功能。根据这种特性，便可以分离到获得了这种基因的重组体克隆。凝胶电泳检测法带有插入片段的重组体在相对分子质量上会有所增加。分离质粒DNA并测定其分子长度是一种直截了当的方法。通常用比较简单的凝胶电泳进行检测。电泳法筛选比抗药性插入失活平板筛选更进了一步。有些假阳性转化菌落，如自我连接载体、缺失连接载体、未消化载体、两个相互连接的载体以及两个外源片段插入的载体等转化的菌落，用平板筛选法不能鉴别，但可以被电泳法淘汰。因为由这些转化菌落分离的质粒DNA分子的大小各不相同，和真正的阳性重组体DNA比较，前三种的DNA分子较小，在电泳时的泳动率较大，其DNA带的位置位于阳性重组DNA带的前面；相反，后两种重组DNA分子较大，泳动率较小，其DNA带的位置位于真阳性重组DNA带的后面。所以，电泳法能筛选出有插入片段的阳性重组体。如果插入片段是大小相近的非目的基因片段，对于这样的阳性重组体，电泳法仍不能鉴别，只有用Southernbbt杂交，即以目的基因片段制备放射性探针和电泳筛选出的重组体DNA杂交，才能最终确定真阳性重组体。限制酶切分析利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。判断的标准：目的DNA分子和载体的分子大小及酶切图谱。用在外源DNA片段上具有识别位点的一种或一种以上的限制性核酸内切酶酶解重组质粒分子，根据酶切图谱分析即可判明插入片段的方向。核酸杂交筛选法从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛使用的一种方法是核酸分子杂交技术。它所依据的原理是利用放射性同位素(32P或125I)标记的DNA或RNA探针进行DNA-DNA或RNA-DNA杂交，即利用同源DNA碱基配对的原理检测特定的重组克隆。直接的免疫化学检测技术同菌落杂交技术在程序上是十分类似的，但它不是使用放射性同位素标记的核酸作探针，而是用抗体鉴定那些产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。只要一个克隆的目的基因能够在大肠杆菌寄主细胞中实现表达，合成出外源的蛋白质，就可以采用免疫化学法检测重组体克隆。免疫化学检测法可分为放射性抗体测定法(radioactiveantibodytest)和免疫沉淀测定法(immunoprecipitationtest)。这些方法最突出的优点是，它们能够检测不为寄主提供任何可选择的表型特征的克隆基因。不过，这些方法需要使用特异性的抗体。放射性抗体检测法现在已被许多实验室广泛采用的放射性抗体测定法所依据的原理为：①一种免疫血清含有好几种IgG抗体，它们识别抗原分子，并分别同各自识别的抗原相结合；②抗体分子或抗体的Fab部分，能够十分牢固地吸附在固体基质(如聚乙烯等塑料制品)上，而不会被洗脱掉；③通过体外碘化作用，IgG抗体便会迅速地被放射性同位素125I标记上。在实际的测定中，首先把转化的菌落涂布在普通培养皿的琼脂平板上，同时，还必须制备影印的复制平板。因为在随后的操作过程中，涂布在普通培养平板上的转化菌落是要被杀死的。接着把细菌菌落溶解，这样便使阳性菌落释放出抗原蛋白质。将连接在固体支持物上的抗体缓慢地同溶解的细胞接触，以利于抗原吸附到抗体上，并且彼此结合成抗原—抗体复合物。然后，将这种吸附着抗原—抗体复合物的固体支持物取出来，与放射性标记的第二种抗体一道温育，以便检出这种复合物。未反应的抗体可以被漂洗掉，而抗原—抗体复合物的位置，则可通过放射自显影技术被测定出来，并据此确定出在原平板中能够合成抗原的细菌菌落的位置。免疫沉淀检测法在生长菌落的琼脂培养基中加入专门抗这种蛋白质分子的特异性抗体，如果被检测菌落的细菌能够分泌出特定的蛋白质，那么在它的周围，就会出现一条由一种叫做沉淀素(preciptin)的抗原—抗体沉淀物所形成的白色的圆圈。表达载体产物之免疫化学检测法现在已经发展出一套专门适用于免疫化学检测技术的表达载体系统。由于这些表达载体都是专门设计的，插入到它上面的真核基因所编码的蛋白质都能够在大肠杆菌寄主细胞中表达，适宜用免疫化学检测法进行检测。原核生物基因表达的特点同所有的生命过程一样，外源基因在原核细胞中的表达包括两个主要过程：即DNA转录成mRNA和mRNA翻译成蛋白质。与真核细胞相比，原核细胞的表达有以下特点：①原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。②原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。调控区主要分为三个部分：操纵子(operator)、启动子(promotor)及其他有调控功能的部位。③由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，转录成mRNA后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成蛋白质。在翻译过程中，mRNA可与一定数目的核糖体结合形成多核糖体。两个核糖体之间有一定长度的间隔，为裸露的mRNA。每个核糖体可独立完成一条肽链的合成，即这种多核糖体可以同时在一条mRNA链上合成多条肽链，大大提高了翻译效率。④原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成mRNA前体后，其中内含子部分不能被切除。⑤原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。对RNA合成的控制有两种方式，一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。⑥在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA3′末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。从上述特点可以看到，欲将外源基因在原核细胞中表达，必须满足以下条件：①通过表达载体将外源基因导人宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；②外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA；③必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基因的表达；④外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(openreadingframe，ORF)；⑤利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。基因表达的调控序列如上所述，由于原核和真核细胞中基因表达的机制是不同的，因此必须详细了解基因表达过程中的各种调控因子，构建高效的表达载体，才能达到高效率、高水平表达外源基因的目的。对原核生物来讲，基因表达的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。1．启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。启动子区域：（1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游5-10bp，一般由6-8个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或–10区。启动子来源不同，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。（2）–35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称–35区，一般由10个碱基组成。启动子有强弱之分，虽然原核细胞仅靠一种RNA聚合酶就能负责所有RNA的合成，但它却不能识别真核基因的启动子。为了表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才在原核表达系统中被转录。在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、PL和PR(λ噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。2．S-D序列mRNA在细菌中的转译效率依赖于是否有核糖体结合位点的存在，即S-D序列以及S-D序列与起始密码子AUG之间的距离。在原核细胞中，当mRNA结合到核糖体上后，翻译或多或少会自动发生。细菌在翻译水平上的调控是不严格的，只有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10bp处的由3~9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16SrRNA3，

末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。S-D序列与起始密码子之间的距离，是影响mRNA转译成蛋白质的主要因素之一。Marqiusv等发现当lac启动子的S-D序列距AUG为7个核苷酸时，IL-2表达最高，为2581单位；而间隔8个核苷酸时，表达水平降到不足5单位，这说明S-D序列与AUG的距离将显著地影响基因的表达水平。另外，某些蛋白质与S-D序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。3．终止子在一个基因的3′端或是一个操纵子的3′端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子(terminator)。对RNA聚合酶起终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C富含区域又具有回文对称结构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构。根据转录终止作用类型，终止子可分为两种，一种只取决于DNA的碱基顺序；另一种需要终止蛋白质(p因子)的参与。在构建表达载体时，为下防止由于克隆的外源基因的表达干扰了载体系统的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA的转录终止子。4．衰减子衰减子(attenuator)是指在某些前导序列中带有控制蛋白质合成速率的调节区。在原核生物中，一条mRNA分子常常编码数种不同的多肽链。这种多顺反子mRNA的头一条多肽链合成的起始点，同RNA分子的5′–P末端间的距离可达数百个核苷酸。这段位于编码区之前的不转译的mRNA区段，叫做前导序列(1eader)。此外，在mRNA的3′–OH末端，以及在多顺反子mRNA中含有的长达数百个碱基的顺反子间序列(intercistranic-sequence)，即间隔序列(spacer)，也发现有不转译的序列。提高克隆基因表达效率的途径为了在大肠杆菌中合成某种特殊的真核生物的蛋白质以满足商品生产的广泛需求，仅仅停留在检测水平上的表达是远远不够的，所以，必须设法提高克隆基因的表达效率。就目前所知，有许多因素，诸如启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞的生理特征等，都会不同程度地影响到克隆基因的表达效率，而且大多数都是在转译水平上发生影响作用的，因而必须从分析这些因素入手，寻找提高克隆基因表达效率的有效途径。1．启动子结构对表达效率的影响为了鉴定出最强的启动子，必须创建出衡量不同启动子转录效率的研究系统。这一系统已由Russell等(1982)创建，他们将任何待测的启动子置于无启动子但处于载体上的半乳糖激酶结构基因(galK)的前方，根据在GalK寄主中所合成的半乳糖激酶的水平，衡量启动子的强弱。结果表明，受检启动子的强弱与它们的一致序列（即与-10和-35区序列）相似的程度成正比。进一步的研究表明，–35和–10区之间的距离也是一个重要因素。如果间隔为17个碱基对，启动子表现很强，如果大于17个碱基对，启动子表现较弱。2．转译起始序列对表达效率的影响实验证明，连接在S—D序列后面的4个碱基成分的改变会对转译效率发生很大的影响。如果这个区域是由4个A(T)碱基组成，其转译作用最为有效；而当这个区域是由4个C碱基或4个G碱基组成，其转译效率只及最高转译效率的50％或25％。直接位于起始密码子AUG左侧的密码三联体的碱基组成，同样也会对转译的效率发生影响。以β–半乳糖苷酶mRNA的转译为例，当这个三联体碱基组分是UAU或CUU时，其转译最为有效，而如果是UUC，UCA或AGG代替了UAU或CUU，那么它的转译水平将下降20倍。3．启动子同克隆基因间距离对表达效率的影响Roberts等(1979)构建了一系列重组质粒，各种质粒之间的区别仅在于启动子和结构基因cro之间的距离不同。将这些不同的重组质粒转化大肠杆菌后，发现cro蛋白质的水平在重组质粒间相差悬殊，最高值比最低值大2000倍。显然，启动子与结构基因间的距离在蛋白质翻译上有巨大作用。进一步的研究还表明：①翻译的起始点和S–D序列必须接近到一定程度；②翻译的起始包括活化的30S核糖体亚基和mRNA5′末端区域间的互作，这时mRNA的5′末端已折叠成特殊的二级结构。基因表达水平的改变是mRNA二级结构的反映。4．转录终止区对克隆基因表达效率的影响在克隆基因的末端，存在一个转录终止区是十分重要的，其原因有如下几个方面：第一，若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质；第二，在转录本上有可能形成一些不期望其出现的二级结构，从而降低了转译的效率；第三，偶然会出现启动子阻塞现象，也就是说，克隆基因启动子所开始的转录，会干扰另一个必要的基因或调节基因的转译。而转录终止区的存在，可使上述这几种不利的现象得以避免。因为有人已经发现，有些强启动子会通读，干扰质粒的复制，结果使质粒的拷贝数反而下降。所以，在基因内部的适当位置上存在着转录的终止区，就能够保证使质粒的拷贝数(也就是基因的表达效率)控制在一个正常的水平上。5．质粒拷贝数及稳定性对表达效率的影响限制蛋白质合成的第一步，是发生在核糖体同mRNA分子结合的过程中的。由于细胞中核糖体的数量与mRNA分子相比是大大超量的，因此，提高克隆基因表达效率的途径之一是增加相应的mRNA分子的数量。怎样才能达到这样的目的呢?影响mRNA分子合成速率的因素有两种：第一种是启动子的强度，这在前面已经作了讨论；第二种是基因的拷贝数。提高基因的拷贝数(即基因的剂量)最简单的办法是，将基因克隆到高拷贝数的质粒载体上。根据实验观察，随着重组体克隆基因表达水平的上升，寄主细胞的生长速率便会相应地下降，同时形态上也会出现一些明显的变化，例如细胞纤维化和脆弱性增加等。如果细菌由于产生出某种突变而失去了重组质粒，或是经过结构的重排使重组基因无法再行表达，或是质粒的拷贝数大大降低，那么这样的突变菌株便会有很高的生长速度，迅速地成为培养物中的优势菌株。而具有重组质粒的寄主细胞，最终便会被“稀释”掉，使克隆基因无法得到表达。由缺陷性分配引起的质粒丢失现象，叫做质粒分离的不稳定性(segregativeinstability)。6．提高翻译水平常用的途径(1)调整S-D序列与AUG间的距离提高外源基因在原核细胞中的表达水平的关键因素之一是调整S-D序列和起始密码子ATG之间的距离，此距离过长、过短都影响真核基因的表达。Marquis人工合成核糖体结合点使S-D序列与起始密码(ATG)的距离为5~9个碱基对，并分别连入7个不同启动子的下游。测试其表达入IL-2的水平，结果发现，在同一种启动子带动下，S-D顺序与ATG间的距离不同，IL-2表达水平可相差2~2000倍。例如在lac启动子带动下，其距离为7个碱基对时，IL-2的表达水平为2581单位，而距离为8个碱基对时，表达水平降至不足5单位。而在PI．启动子带动下，其距离为6个碱基时，IL-2表达水平达9707单位，距离为8个碱基对时，表达水平降至5363单位。这表明根据不同的启动子，调整好S-D序列与起始密码ATG的距离，确实可提高外源基因的表达水平。(2)用点突变的方法改变某些碱基翻译的起始是决定翻译水平高低的一个重要因素。有资料表明，由于紧随起始密码下游的几组密码子不同，可使基因的表达效率相差15~20倍。这主要是改善了翻译的起始和mRNA的二级结构。另外，有人对大肠杆菌各种基因顺序进行了大量分析，根据不同密码子使用频率，将64组密码子分为强、中、弱密码子。如果在不改变编码的氨基酸顺序的条件下，尽量用强密码子取代弱密码子，确有可能提高表达水平。但是，大量的研究表明，含有弱密码子的真核基因是能够在大肠杆菌获得高效表达的。可见，密码子的使用问题并非是影响外源基因在大肠杆菌中表达水平的决定因素。(3)增加mRNA的稳定性多数情况下，细菌的mRNA的半衰期很短，一般仅为1~2min，而外源基因mRNA的半衰期可能更短。若能增加mRNA的稳定性，则有可能提高外源基因的表达水平。研究表明，大肠杆菌的“重复性基因外回文序列”(repetitiveextragenicpdindronicsequence)具有稳定mRNA的作用，能防止外切酶的攻击。因此，在外源基因下游插入此序列或其他具有反转重复顺序的DNA片段可起到稳定mRNA、提高表达水平的作用。7．减轻细胞的代谢负荷外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢；而细胞代谢的损伤，又必然影响外源基因的表达。合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，是提高外源基因表达水平不可缺少的一个环节。目前常用的方法有：(1)诱导表达使细菌的生长与外源基因的表达分开。将宿主菌的生长与外源基因的表达分开成为两个阶段，是减轻宿主细胞代谢负荷的最为常用的一个方法。一般采用温度诱导或药物诱导。如应用tac启动子时，常用F′tac4的菌株或者将lacI基因克隆在表达质粒中。当宿主菌生长时，lacI产生的阻遏物与lac操纵基因结合，阻碍了外源基因的转录及表达，此时，宿主菌大量生长。当加入诱导物(如IPTG)时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。有人认为，化学诱导比温度诱导更为方便和有效，并且将相应的阻遏蛋白基因直接克隆到表达载体上，比应用含阻遏蛋白基因的菌株更为有效。(2)表达载体的诱导复制减轻宿主细胞代谢负荷的另一个措施是将宿主菌的生长和表达质粒的复制分开。当宿主菌迅速生长时，抑制质粒的复制；当宿主菌生物量积累到一定水平后，再诱导细胞中质粒DNA的复制，增加质粒的拷贝数，拷贝数的增加必然导致外源基因表达水平的提高。质粒pCll01是温度控制诱导DNA复制最好的例子。用此质粒转化宿主菌，25℃时宿主中仅有此质粒10拷贝，宿主细胞大量生长；但当温度升高到37℃时，质粒大量复制，每个细胞中质粒拷贝数可高达1000个。8．提高表达蛋白的稳定性，防止其降解在大肠杆菌中表达的外源蛋白质往往不够稳定，常被细菌的蛋白酶降解，因而会使外源基因的表达水平大大降低。因此，提高表达蛋白质的稳定性，防止细菌蛋白酶的降解是提高外源基因表达水平的有力措施。(1)克隆一段原核序列，表达融合蛋白这里的融合蛋白是指表达的蛋白质或多肽N末端由原核DNA编码，C末端是由克隆的真核DNA的完整序列编码。这样表达的蛋白是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起，故称为融合蛋白。融合蛋白是避免细菌蛋白酶破坏的最好措施。在表达融合蛋白时，为得到正确编码的表达蛋白，在插人外源基因时，其阅读框架与原核DNA片段的阅读框架一致，只有这样，翻译时插入的外源基因才不致产生移码突变。(2)采用某种突变菌株，保护表达蛋白不被降解大肠杆菌蛋白酶的合成主要依赖次黄嘌呤核苷(lon)，因此采用lon-缺陷型菌株作受体菌，则使大肠杆菌蛋白酶合成受阻，从而使表达蛋白得到保护。Baker发现大肠杆菌htpR基因的突变株也可减少蛋白酶的降解作用。另外，T4噬菌体的pin基因产物是细菌蛋白酶的抑制剂，将pin基因克隆到质粒中并转化入大肠杆菌中，细菌的蛋白酶便受到抑制，外源基因的表达产物受到保护。(3)表达分泌蛋白表达分泌蛋白是防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢负荷及恢复表达产物天然构象的最有力措施。在原核表达系统中，人们研究得比较多的主要是大肠杆菌。大肠杆菌主要由4部分组成：胞质、内膜、外膜及内外膜之间的周间质。一般情况下，所谓“分泌”是指蛋白质从胞质跨过内膜进人周间质这一过程。而蛋白质从胞质跨过内、外膜进人培养液这种情况较为少见，被称为“外排”以区别于“分泌”。蛋白质能够在大肠杆菌中进行分泌，至少要具备3个要素：①有一段信号肽；①在成熟蛋白质内有适当的与分泌相关的氨基酸序列；②细胞内有相应的转运机制。③信号肽：信号肽序列对于分泌蛋白质是必需的，其长度一般为15~30个氨基酸。分离纯化的一般步骤：1．发酵液的预处理2．细胞分离3．细胞的破碎:破碎方法有变性剂裂解法、超声破碎法、机械破碎法、酶溶法和反复冻融法等。4．离心分离5．样品的浓缩:沉淀法、超滤法、吸附/洗脱层析6．柱层析分离方法：利用柱层析纯化蛋白质包括装柱、柱平衡、上样、洗脱、分部收集与检测等步骤。不同表达形式的蛋白质分离纯化包涵体：大肠杆菌表达系统表达的真核生物重组小分子目的蛋白，可占菌体总蛋白的10％-50％，这样的高产量使某些目的蛋白质在细胞质的还原性环境中，以不溶性形式产生并聚集形成蛋白质聚合物包涵体。包涵体的特点①包涵体具有高密度，并且在水溶液中通常不溶解，可以通过简单的离心就可分离得到，可以较容易地与胞内可溶性蛋白杂质分离，有利于表达产物的分离纯化。②重组蛋白以包涵体的形式表达有效地抵御了大肠杆菌中蛋白酶对表达蛋白的降解。③对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白，包涵体的形成无疑是级佳选择，包涵体的形式在一定程度上改变了传统分离纯化蛋白质的方法。包涵体的分离纯化步骤通常包括：1）细菌收集与破碎，2）包涵体的分离、洗涤与溶解，3）变性蛋白质的纯化，4）重组蛋白质的复性，5）天然蛋白质的分离。融合蛋白的分离纯化利用基因工程技术，通过在目的DNA的3’端或5’端插入DNA序列，进而改变蛋白质两端的氨基酸序列，产生纯化方便的融合蛋白。融合子赋予蛋白质特定的纯化性质，使其适用于免疫亲和、金属螯合、离子交换、疏水色谱以及其他分离操作。纯化融合蛋白的原理简单1）融合蛋白的提取2）融合蛋白的重折叠3）融合蛋白的纯化4）天然蛋白的回收5）蛋白质的水解保护分泌型表达产物分泌型的表达产物通常体积大、浓度低、必须在纯化以前进行浓缩处理，以尽快缩小溶液体积。浓缩的方法包括沉淀和超滤等。沉淀包括中性盐、有机溶剂和高分子聚合物等方法，在基因工程产物浓缩中并不被广泛采用。超滤是目前最常用的蛋白质溶液浓缩方法。其优点是不发生相变化，也不需要加入化学试剂，能耗低，目前已有多种截留不同分子量的膜供应。蛋白产物经过浓缩后便可进一步分离纯化。纯化方法的选择多根据发酵液中的有效成分和杂质之间的理化性质存在的差异来考虑选择。例如存在较大溶解度差异可选择沉淀法；电荷差异大可选用离子交换；分子量差异大可选择凝胶过滤；对配体亲和力的差异大可选用亲和层析；疏水性强可选择疏水层析。因此，不同的样品应根据具体的情况来确定。大肠杆菌细胞内可溶性表达产物某些细胞因子和硫氧还原蛋白的基因能在大肠杆菌胞内表达可溶性的融合蛋白，表达量占细胞总可溶蛋白的5％-20％，有的高达40％。这种表达方式可避免无活性的不可溶包涵体的形成，使外源蛋白在大肠杆菌细胞中能正确折叠从而获得特定空间结构和生物功能，并以可溶性形式表达。同时，可大大简化纯化工艺，降低成本，获得高纯度高活性的目的蛋白。经细胞破碎后的可溶性离心上清液，如果有可以利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，可选用亲和层析分离法。对处于极端等电点的蛋白质，采用离子交换分离能去除大部分杂质，也可获较好的纯化效果。我国在大肠杆菌中高效表达的hG-CSF-硫氧还蛋白融合蛋白，采用固相金属螯合层析法，方便而有效地从细胞破碎可溶上清液中直接纯化。大肠杆菌细胞周质表达蛋白周质表达蛋白是介于细胞内可溶性表达和分泌型表达之间的一种表达形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于蛋白产物的分离纯化。为了获取周质蛋白，大肠杆菌细胞经低浓度溶菌酶处理后，一般用渗透压裂解法获取。由于周质中的蛋白仅有为数不多的几种分泌蛋白，同时又无蛋白水解酶的污染，因此通常能够回收到高质量的蛋白产物。