抑制STAT3增强对吉非替尼耐药的非小细胞肺癌药物敏感性的研究

的研究

王竞;姜斌;郭跃辉;时婧;公小迪

【摘 要】Objective:To explore the correlation of the drug susceplibilily of gefilinib-resislanl in non-small cell lung cancer(NSCLS) induced by T790M mulation in EGFR and signal transducers and aclivalors of Lranscription 3(STAT3). Methods:H1975 and PC9 cells were dealed with different concentrations of STAT3 specific inhibitor JSI-124. The inhibition rale of cells and the levels of prolein and mRNA of relalive factors were

determined by CCK-8, Western blot and RT-PCR,respeclirely. Results:The STAT3 expression of H1975 cells with EGFR T790M mulation of NSCLC were obviously higher than that in PC9 cells( P < 0. 01) . JSI-124 inhibited the aclivily of STAT3 in H1975 mulation cells in dose-and time-dependenl manner and improved the susceplibilily of gefilinib,bul not for PC9 cells. Conclusions:The gefilinib-resislanl mechanism induced by T790M mulation in EGFR is related to STAT3, which can be reversed by inhibiting the STAT3 aclivily.%目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中表皮生长因子受体T790M突变导致的吉非替尼耐药与信号转导及转录激活因子3(STAT3)的相关性.方法:不同浓度STAT3特异性抑制剂JSI-124处理NSCLC H1975细胞和PC9细胞后,CCK-8法检测细胞抑制率,Western blot法检测蛋白水平表达,RT-PCR法检测相关基因mRNA水平的表达.结果:NSCLC中EGFR T790M突变的H1975细胞中STAT3的表达明显高于PC9细胞(P<0.01);JSI-124可剂量和时间依赖性地抑制H1975突变细胞中STAT3的活性,并能增强其对吉非替尼的敏感性.且此现象未在对吉非替尼

敏感的PC9细胞中观察到.结论:STAT3因子与表皮生长因子受体T790M突变导致的吉非替尼耐药机制相关,抑制STAT3活性可逆转吉非替尼耐药. 【期刊名称】《蚌埠医学院学报》 【年(卷),期】2013(038)004 【总页数】5页(P384-388)

【关键词】癌,非小细胞肺;吉非替尼;耐药性;信号转导及转录激活因子3 【作 者】王竞;姜斌;郭跃辉;时婧;公小迪

【作者单位】上海交通大学医学院附属第三人民医院,肿瘤科,上海,201900;上海交通大学医学院附属第三人民医院,肿瘤科,上海,201900;上海交通大学医学院附属第三人民医院,肿瘤科,上海,201900;上海交通大学医学院附属第三人民医院,肿瘤科,上海,201900;上海交通大学医学院附属第三人民医院,肿瘤科,上海,201900 【正文语种】中 文 【中图分类】R734.2

目前，在对非小细胞肺癌(non－small－cell lung cancer，NSCLC)的治疗中，尽管采用手术、化疗、放疗和中成药等综合治疗，5年生存率仍少于10%［1］，为改善此种情况，靶向治疗NSCLC研究成为当务之急。吉非替尼是被20多个国家批准用于治疗晚期NSCLC的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，且对带有EGFR激活突变的NSCLC患者疗效显著，相对于传统化放疗具有更大优势［2］。晚期 NSCLC 患者在使用 EGFR－TKI前可进行EGFR突变检测［3－4］，外显子

21替代突变或外显子19缺失突变的患者，临床有效率较高，然而临床观察发现几乎所有原先对吉非替尼治疗有效的NSCLC患者在经过一段时间(10个月左右)的缓解期后出现疾病进展，即获得性耐药［5］。50%以上耐药与EGFR二次突变有关，即带有L858R(外显子21替代突变)或 DelE746－A750(外显子19缺失突变)的患者，又出现T790M(外显子20替代突变)第二个突变位点，进而导致EGFR酪氨酸激酶构象改变，吉非替尼无法与之结合并抑制其活性［6］。因此，需要更有效的策略来防止或逆转药物耐受的现象出现。信号转导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)是STAT家族的重要成员，也是EGFR下游JAK－STAT3通路的关键因子。此通路与细胞增殖、分化及凋亡密切相关。STAT3的异常激活可刺激下游抗凋亡蛋白 Bcl－2、Bcl－xl、Mcl－1 与增殖相关蛋白 Cyclin D1、Myc等表达，致使细胞异常增殖与恶性转化，因此可被看作是一种癌基因［7］。研究［8］显示，在一些恶性肿瘤中，持续活化的STAT3通路对化疗诱导的凋亡有抑制作用，其下游抗凋亡相关蛋白的异常表达是导致肿瘤产生多药耐药的主要机制之一。

本研究旨在探讨携带T790M突变的NSCLC耐药细胞株H1975中STAT3通路的活化效应是否与吉非替尼的耐药机制相关，抑制STAT3通路能否逆转其耐药，为以STAT3为靶点的NSCLC治疗提供依据。 1 材料与方法

1.1 试剂 RPMI 1640细胞培养液(干粉)、胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，CCK－8(Dojindo公司)，STAT3特异性抑制剂 JSI－

124(Calbiochem公司)，JAK2特异性抑制剂AG490、吉非替尼(Sigma公司)，一抗 STAT3、P－STAT3(针对705位酪氨酸磷酸化位点)、GAPDH(CST公司)，BCL－2、BAX(Santa Cruz 公司);二抗(Jackson 公司)，Trizol(Invitrogen 公 司)，RT－PCR 试 剂 盒(TaKaRa公司);引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

试剂溶于二甲基亚砜(DMSO)中，－20℃保存，实验时稀释到相应的工作浓度，保证工作液中DMSO的含量不高于0.1%。

1.2 细胞培养 人肺腺癌细胞 H1975(EGFR L858R/T790M)购自中科院上海生物细胞研究所，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液;PC9细胞(EGFR DEL E746－A750)由上海肺科医院肺癌免疫研究室馈赠，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液，均置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。

1.3 CCK－8法检测细胞抑制率 取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，5 000个/孔(每孔200μl)接种于96孔板，贴壁生长后，分别加入不同浓度的所需药物，每个浓度设6个复孔;同时，设调零组(仅含培养基不含细胞)和对照组(仅含细胞和培养基不含药物的孔)，继续培养48 h后每孔加入CCK－8 20 μl，37 ℃、5%CO2培养箱孵育2 h，用酶标仪测定490 nm波长处每孔的光密度(OD)值，实验重复3次。细胞抑制率(%)=［1－(OD实验孔 －OD调零孔)/(OD对照孔 －OD调零孔)］×100%;计算半数抑制浓度(IC50);耐药指数(RI)=耐药细胞系的IC50/敏感细胞系的IC50。

1.4 RT－PCR法检测相关基因 Trizol试剂提取细胞中的总RNA，紫外分光光度计测定260及280 nm处的吸收值，如OD260/OD280＞1.8，证明纯度较高，计算核酸浓度，并将提取的总RNA溶于DEPC水。根据 TaKaRa RT－PCR试剂盒说明书，对 STAT3、CyclinD1进行反转录和聚合酶链式反应，以GAPDH为内参，具体引物序列见表 1。RT－PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳并鉴定。实验重复3次。

表1 RT－PCR引物序列名称 序列 终长度STAT3 5'－ATA

GCCGCTTCCTGCAAGAG－3'5'－CGT CCGTGA GAGTTTTCTGC－3'510 bp CyclinD1 5'－GAGACCATCCCCCTGACGGC－3'5'－

CTCTTCCTCCTCCTCGGCGGC－3' 484 bp GAPDH 5'－CCT TCA TTG ACCTCA

ACT A－3'5'－GGA AGGCCA TGCCAGTGA GC－3'594 bp

1.5 Western blot法检测蛋白表达 经药物处理后的细胞，提取总蛋白。分别将相同含量的蛋白样品和上样缓冲液(5倍)按适当体积混合，100℃、10 min使蛋白变性;10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入1∶1 000稀释的一抗，4℃过夜;TBST洗膜3次，10分/次;加入1∶2 500稀释的二抗，室温孵育1 h;TBST洗膜2次，TBS洗膜1次后显色;用BIO－RAD公司扫胶仪，以GAPDH为内参，Quantity one软件对蛋白条带进行灰度分析比较。实验重复3次。

1.6 统计学方法 采用方差分析和q检验及t检验。 2 结果

2.1 EGFR L858R/T790M双突变的H1975细胞中STAT3 活性 CCK－8 法检测经 0、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 μmol/L 吉非替尼处理 H1975 和PC9细胞24 h后，与PC9细胞相比，H1975细胞对吉非替尼不敏感(见图1)。H1975和PC9细胞对吉非替尼的 IC50分别为(19.55 ±1.66)、(1.24 ±0.27)μmol/L;RI为 15.76。H1975 细胞中磷酸化STAT3(Y705)的蛋白水平表达明显高于PC9细胞(P＜0.01)，总STAT3无明显变化。与此同时，H1975细胞也表达更多的STAT3下游抗凋亡蛋白Bcl－2(P ＜0.01)(见图 2 及表2)。

表2 H1975 和 PC9 细胞中 P－STAT3、总 STAT3 和 Bcl－2密度值的变化(ni=3)细胞类型 P－STAT3 总STAT3 Bcl－2 H1975 0.93 ±0.09 0.16 ±0.04 0.68 ±0.06 PC9 0.46 ±0.06 0.15 ±0.01 0.38 ±0.05 t 7.53 0.42 6.65 P ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01

2.2 STAT3特异性抑制剂 JSI－124对 H1975细胞中STAT3的活化抑制效应 不同浓度(0、0.5、1.0、3.0、10 μmol/L)JSI－124 处理 H1975 细胞。Western

blot检测结果显示，JSI－124可剂量依赖性的抑制STAT3的活化，总STAT3的表达水平未见明显变化。比较 JSI－124 处理 6、24 h 的结果发现，JSI－124对STAT3活性的抑制同时也具时间依赖性，并发现在1μmol/L处理24 h时JSI－124能明显抑制STAT3活化(P＜0.01)(见图3及表3);且抗凋亡蛋白Bcl－2的蛋白水平也随之减少，Bax凋亡蛋白水平增多，提示JSI－124可促进细胞凋亡能力的增加。

表3 不同浓度JSI－124对P－STAT3不同时间密度值的影响(ni=3)q检验:与对照组比较*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与 0.5 μmol/L比较△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与1.0 μmol/L 比较#P ＜0.05，##P ＜0.01;与3.0 μmol/L 比较 +P ＜0.05P－STAT3 相对密度值6 h 24 h对照组JSI－124(μmol/L)0.88 ±0.09 0.97 ±0.07 0.5 0.82 ±0.05 0.78 ±0.04＊＊1.0 0.74 ±0.11 0.36 ±0.08＊＊△△3.0 0.62 ±0.08＊△ 0.18 ±0.03＊＊△△##10.0 0.49 ±0.08＊＊0.007

0.003△△##0.08±0.02＊＊△△##+F 10.39 156.95 P＜0.01 ＜0.01 MS组内 2.3 JSI－124抑制H1975细胞增殖及增加其对吉非替尼的敏感性 以 DMSO为对照，不同浓度(0、0.08、0.16、0.32、0.64、1.25、2.5、5、10 μmol/L)JSI－124处理后，随着时间延长，JSI－124对 H1975细胞的抑制率也逐渐升高(见图4)。RT－PCR示，随着JSI－124浓度的增加，STAT3 mRNA的表达逐渐下降，其下游与增殖相关基因CyclinD1的表达也减少(见图 5)。H1975和 PC9细胞在不同浓度(0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 μmol/L)吉非替尼作用下与1μmol/L JSI－124联合或单独处理48 h后，JSI－124能显著增加H1975细胞对吉非替尼的敏感性，使H1975细胞对吉非替尼的IC50值降低约5倍左右。但是这种效应并未在敏感的PC9细胞中体现(见图6)。

2.4 AG490抑制STAT3活化，逆转H1975细胞对吉非替尼的耐药性 AG490能

剂量依赖性的抑制STAT3蛋白表达，在100μmol/L处理时降低到对照的37%(见图7)。与 JSI－124相似，AG490也能显著增强H1975细胞对吉非替尼的敏感性(见图8)，降低H1975对吉非替尼IC50值的3～5倍。RT－PCR示，AG490同样减少STAT3在mRNA水平的表达，并下调增殖相关因子 CyclinD1(P＜0.05～P＜0.01)(见图9及表4)，提示AG490也可通过抑制STAT3活性，逆转吉非替尼耐药。

表4 不同浓度AG490对STAT3和CyclinD1密度值的影响()q检验:与对照组比较*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与 50 μmol/L比较△△P ＜0.01AG490浓度STAT3 CyclinD1对照组(μmol/L) n PCR相对密度值3 0.68 ±0.04 0.73 ±0.08 50 3 0.39 ±0.06＊＊ 0.57 ±0.04*100 3 0.12 ±0.02＊＊△△0.26±0.06＊＊△△F—126.05 44.30 P 0.002 0.004＜0.01 ＜0.01 MS组内 —— 3 讨论

已有研究［9］表明，肺癌细胞中EGFR酪氨酸激酶编码区基因突变可预测EGFR－TKIs的敏感性。近年来，临床使用EGFR－TKIs中发现绝大多数的患者在缓解期后会出现获得性耐药，T790M突变是主要原因，其耐药机制有以下两点:(1)甲硫氨酸替代苏氨酸，出现位阻效应，酪氨酸激酶残基与结合在ATP口袋中药物的结合减少;(2)增加酪氨酸激酶残基与ATP的亲和力，使突变型受体药物与ATP的结合力恢复至野生型 EGFR 水平［10－11］。EGFR T790M 突变可导致吉非替尼耐药［6，12］，但其具体耐药机制尚不明确。

STAT3作为癌基因，在恶性肿瘤中持续活化。由于EGFR突变的NSCLC细胞中STAT3活化水平明显升高，STAT3的活化被看作是存在EGFR体细胞突变的NSCLC致癌的必要因素［13］。在许多血液系统肿瘤和实体瘤中，STAT3的持续

激活能上调凋亡抑制因子 Bcl－2、Bcl－xl、MCL－1 及细胞周期调控因子C－myc、CyclinD1等的表达，刺激细胞增殖、阻碍凋亡，并介导对多种化疗药物的耐药［14］。抑制STAT3的活化可提高胃癌、卵巢癌及恶性黑素瘤等的化疗敏感性［15－17］。此外，还有研究［18－19］也指出在耐顺铂的肺癌以及其他耐药癌细胞中STAT3 mRNA水平较敏感细胞增高。然而，目前对NSCLC中STAT3与吉非替尼耐药相关性的认识并不充分。

JSI－124(Cucurbitacin I)是 STAT3 的特异性抑制剂，其能选择性抑制STAT3磷酸化与DNA结合，从而抑制依赖STAT3的肿瘤细胞增殖，但对其他生长增殖相关激酶如 AKT、ERK、JNK和 Src等无影响，且在体内外都未显示毒性［20］。因此，我们选择JSI－124抑制STAT3磷酸化，STAT3的活性与EGFR T790M突变导致的吉非替尼耐药机制的关系。结果显示，JSI－124可剂量和时间依赖性地抑制H1975突变细胞中STAT3的活性，并能增强H1975耐药细胞对吉非替尼的敏感性，此外，JAK2的抑制剂AG490作用于STAT3信号通路也出现了类似结果。 综上所述，肺腺癌细胞株H1975中STAT3活性明显高于敏感细胞株PC9，且STAT3可能在耐药肿瘤细胞中发挥双重功能。通过抑制STAT3，能减少肿瘤细胞的增殖，同时还能逆转EGFR T790M突变细胞对吉非替尼的耐药性。STAT3抑制剂可考虑作为对EGFR抑制剂不敏感的NSCLC患者逆转其耐药的方法之一，为JSI－124或其他STAT3抑制剂应用于逆转吉非替尼耐药提供了临床应用基础。 ［参考文献］

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