应用于作物体细胞杂种鉴定的遗传标记方法

北方园艺２００７（１２）：５５～５９　・专题综述・　应用于作物体细胞杂种鉴定的遗传标记方法　张　瑜，赵云云　（首都师范大学生命科学学院，北京１０００３７）　摘要：着重介绍了４类遗传标记方法的原理及特点，简要概述了其在作物体细胞杂种鉴定　方面的应用进展。　关键词：体细胞杂种；遗传标记　中图分类号：Ｑ　９４３文献标识码：Ａ文章编号：１００１－－０００９（２００７）ｌ２一Ｏ０５５一Ｏ５　作物体细胞杂种的鉴定研究离不开遗传标记，遗传　标记是遗传物质的特殊的易于识别的表现形式，可以用　于研究基因遗传和变异的规律。随着分子生物学和生　物技术的迅速发展，遗传标记技术也得到了迅猛的发　植株形态、叶片形态、花器官形态、果实特征等形态　学特征是判断及筛选体细胞杂种的基本而又重要的标　准。形态学标记可以直接的体现杂种与双亲的形态区　别，方法非常简单。但是它易受环境和其它遗传效应影　响，且标记的数量较少。　展。目前，遗传标记主要分为四大类：形态学标记、细胞　学标记、生化标记和分子标记。形态学标记指可以观察　到的一些表型性状；细胞学标记主要包括核型、染色体　２细胞学标记　核型、染色体带型和原位杂交及染色体的非整倍性　和结构变异等细胞学标记是鉴定体细胞杂种的一种有　效的方法。　带型等；生化标记主要是指同工酶和贮藏蛋白质等生化　物质；分子标记是以生物大分子，尤其是生物体的遗传　物质一一核酸的多态性为基础的遗传标记。　２．１制片分析　１形态学标记　第一作者简介：张瑜（１９８２一），女．硕士．主要从事植物细胞工程研　究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｙｕｌ９８２ｌ０３ｌ＠１６３．ｃｏｍ。　通常以根尖、茎尖、幼叶、叶片愈伤组织等为材料，　采用压片法进行染色体标本制备，需用卡宝品红、醋酸　洋红等染色液进行染色、镜检和计数。制片分析作为最　基本的细胞学分析手段，方法比较简单，但是易受材料　和时间的限制。　２．２原位杂交　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ，ｄｅｆｅｎｓｅｓ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，１９９９，１１：１９１—２０６．　通讯作者：赵云云。Ｅ－ａｉｍｌ：ｋｊｃ－ｚｈａｏｙｙ＠ｍａｉｌ．ｃｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。　收稿日期：２Ｏ０７一Ｏ６～２５　［２６］Ｋａｗａｅａ￣Ｔ，Ｈｅｎｍｉ　Ｋ，Ｏｎｏ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｓｍａｌｌ　ＧＴＰ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏ—　ｔｅｉｎ　Ｒａｃ　ｉｓ　ａ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　ｔ９９９，９６：１０９２２—１０９２６．　［２９］Ｄｅｌｌｅｄｏｎｎｅ　Ｍ，Ｘｉａ　Ｙ，Ｄｉｘｏｎ　Ｒ　Ａ，ｃｔ　ａ１．Ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ａｓ　ａ　［２７３　Ｈｅｏ　Ｗ　Ｄ，Ｌｅｅ　Ｓ　Ｈ，Ｋｉｍ　Ｍ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃａｌｍｏｄｕ—　ｌｉｎ　ｉｓｏｆｏｒｍｓ　ｉｎ　ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｉｓｅｄａｓｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｉｓｅａｓｅ　ｒｅｓｉｄｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９４：５８５—５８８．　［３Ｏ］Ｐｅｄｒｏｓｏ　Ｍ　Ｃ，Ｍａｇａｌｈａｅｓ　Ｊ　Ｒ，Ｄｕｒｚａｎ　Ｄ　Ｎｉｔｉｒｃ　ｏ）ｄｄｅ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　ｉｎ　ｔａｘｕｓ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ，２０００，１５７：１７３－１８０．　［３１］崔克明．植物细胞程序性死亡的机理及其与发育的关系［Ｊ］．植物　学通报，２０００，１７（２）：９７—１０７．　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１９９９，９６：７６６—７７１．　［２８］Ｒａｔｅ　Ｄ　Ｎ，Ｃｕｅｎｃａ　Ｊ　Ｖ，Ｂｏｗｍａｎ　Ｇ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ａｇａｉｎ—ｏｆ—ｆｕｎｃｔｉｏｎ　Ａｒａ—　ｂｉ　ｄｏｐｓｉｓ　ａｃｄ６　ｍｕｔａｎｔ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｎｏｖｅｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｓｔｒｅｓｓ　ＣＡＯ　Ｈｕｉ，ＬＩＵ　Ｈｅ，ＦＵ　Ｘｕｎ－ｃｈｅｎｇ，Ｈ　Ｃｈｕｎ－ｍａ　（Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｓｈａｎｘｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｔａｉｇｕ，Ｓｈａｎｘｉ　２６１０６１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ（ＰＣＤ）ｉｓ　ａｎ　ａｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｗｈｉｃｈ　ｐｌａｙｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｒｅｖｉｅｗ，ｗｅ　ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ　ｒｅｃｅｎｔ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ＰＣＤ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｎｃｌｕ—　ｃｌｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｏｆ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ＰＣＤ，ｔｈｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ＰＣＤ　ａｎｄ　ＳＯ　ｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｌａｎｔ；Ｓｔｒｅｓｓ；Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　５５　维普资讯 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・专题综述・　１９６９年Ｇａｌｌ、Ｐａｒｄｕｅ和Ｊｏｈｎ等（２００２）首次建立该技　术，并应用于组织切片和细胞标本上。原位杂交技术（ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＳＨ）是根据核酸分子碱基互补配对原　则，利用标记探针与组织、细胞或染色体的ＤＮＡ进行杂　交，对细胞中的待测核酸进行定性、定位或相对定量分　析（张明，曹家树，２０００）。　随着组织化学和分子生物学的进一步的发展，染色　体原位杂交技术不断改进。在植物体细胞杂种研究方　面，原位杂交技术日益显示出其优势，可用于倍性变异　的来源检测、融合双亲的基因组互作、染色体行为分析　等。例如，Ｉｔｏｈ等（１９９１）应用原位杂交技术对油菜非对　称杂种进行了研究，发现所检测的５个杂种都丢失了供　体ｌ～３条染色体。　２．２．１特异片断的荧光原位杂交２Ｏ世纪８Ｏ年代末，　出现了利用荧光素进行标记或检测的荧光原位杂交　（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩｓＨ）技术，使信号检　出率提高。Ｗａｎｇ等（２００５）通过ＦＩＳＨ技术分析ｗｈｅａｔ　和Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｅｌｏｎｇｃｌｔｕｍ的体细胞杂种，发现杂种中有　Ａ．ｅｌｏｎｇａｔｕｍ的小染色体片断，从而证明了杂种的性　质。ＦＩＳＨ比ＩＳＨ有两个优点：不同的探针可以同时测　定几个不同序列在染色体上的物理顺序；通过数字成像　显微技术就可以获得更为准确的图谱。　２．２．２基因组原位杂交采用整个基因组的ＤＮＡ可　作为ＦＩｓＨ探针来识别植物杂种、异源多倍体和重组的　育种品系中不同来源的染色体和染色体片段，这…重要　的ＦＩＳＨ技术变型称为基因组原位杂交（ｇｅｎｏｍｉｃ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＧＩＳＨ）。Ｗｏｈｅｒｓ等（１９９４）应用ＧＩＳＨ技术　研究了番茄与马铃薯属问体细胞杂种的有丝分裂、减数分　裂行为，发现存在很多异常现象。ＧＩＳＨ技术更直接简便，　可与整条染色体杂交，而且杂交位点可以在细胞分裂任何　时期观察到。通过ＧＩＳＨ不仅能了解配对同源染色体的　来源，还能观察到异源染色体易位互换重组现象。　２．３流式细胞仪分析　通过流式细胞分析仪（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，ＦｃＭ）对大量　处于分裂期间染色体的细胞Ｉ）ＮＡ含量进行检测，经仪　器的附设计算机自动进行统计分析，绘制出ＤｉＮＡ含量　（倍性）的分布曲线图。以已知倍性的同类试材为对照，　确定待测植株的倍性。相对常规染色体制片法来说，采　用流式细胞仪进行倍性分析操作简便，不受材料和时问　的限制。但该方法的单独使用，尚不能鉴别出是否为异　源四倍体、二倍体胞质杂种，而且流式细胞仪价格昂贵、　使用成本较高。　３生化标记　生化标记（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｒｎａｒｋｅｒ）主要是同工酶　（ｉｓｏｚｙｍｅ）和种子贮藏蛋白（如醇溶蛋白）等生化物质的　遗传标记。　５６　北方园艺２ｏｏ７（１２）：５５～５９　３．１同功酶分析　由于酶的结构主要是由遗传物质ＤＮＡ分子上碱基　排列顺序决定的，因此对酶的分析可以间接反映不同生　物的不同基因结构。同功酶结构上的差异，可在电流中　表现出来，因而易于识别。　国内外近年来用同功酶分析法鉴定杂种，已取得了　一些结果。Ｔｒａｂｅｌｓｉ等（２００５）通过ＰＥＧ处理ｐｏｔａｔｏ　Ｓｏ—　ｌａｎｕｍ　Ｌ．ｔｕｂｅｒｏ　和Ｓｏｌａｎｕｍ　ｖｅｒｎｅｉ的原生质体融合　得到了５棵再生植株，采用酯酶和过氧化酶分析来初步　鉴定再生株的杂种特性。　３．２蛋白质分析　各种蛋白质都有其特有的等电点，在高于其等电点　ｐＨ的缓冲液中，将形成带负电荷的质点，在电场中向正　极泳动，在同一条件下，不同蛋白质带电荷有差异，分子　量大小也不同，所以泳动速度不同，蛋白质可分成多条　区带。向凤宁等（２００１）采用双向电泳技术分析杂种蛋白　质组分可见，杂种不仅含有双亲的蛋白质组，而且还产　生了特异的新蛋白。　在电泳和等电聚焦时，蛋白质迁移率的差异、共显性　等蛋白质多态性在数量上是有限的。很多蛋白质的多态　性不能通过电泳检测，因为氨基酸改变了，蛋白质的物化　性质没变。而且，基因编码的多态性蛋白质本身可能不被　作图。由于这些因素，蛋白质标记具有一定局限性。　４分子标记　分子标ｉＥ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒ）是以生物的某些大分　子物质（主要指核酸）的多态性为基础的遗传标记。依　其多态性检出所用的分子生物学技术，大致可分为以　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术为核心的分子标记和以ＰＣＲ技术为　核心的分子标记。　４．１基于Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术的分子标记　该技术利用限制性内切酶酶解不同生物体的ＤＮＡ　分子后，用特异探针进行ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，通过放射自显　影或非同位素来检测ＤＮＡ的多态性，其中最具代表性　的是发现最早的限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ，ｒｅｓｔｒｉｃ—　ｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）。其基本原理是用　限制性内切酶把ＤＮＡ分子降解成大量的长短不等的小　片段，这些小片段的数目及长度反映了限制性内切酶酶　切位点在ＤＮＡ分子上的分布。不同来源的ＤＮＡ具有　不同的限制酶酶切位点的分布，每一种ＤＮＡ／限制酶组　合所产生的片段是特异的，从而产生多态性。其可靠性　高，是共显性标记。但ＤＮＡ用量大，操作繁琐，技术复　杂，工作量大，有放射性危害。　Ｃｈｅｎｇ等（２００４）曾运用ＲＦＩ　Ｐ标记技术对Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉ　ＵＵＪＨ和Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ体细胞杂种的线粒体　基因进行分析，发现杂种细胞是供体和受体基因自由组　合和分离的结果。　维普资讯 http://www.cqvip.com 北方园艺２ｏｏ７（１２）：５５～５９　４．２以ＰＣＲ技术为基础的分子标记　ＰＣＲ技术即聚合酶链式反应，就是利用ＤＮＡ聚合　酶进行体外扩增ＤＮＡ的技术，方法简便、快速。根据　・专题综述・　扩增出的产物为简单序列重复之间的ＤＮＡ序列。　ＳＰＡＲ标记技术：ＰＡＳＲ，单引物扩增反应。该标记系统　由Ｇｕｐｔａ等（１９９４）提出，其技术流程同ＲＡＰＤ。该系统　所用引物为微卫星序列或简单序列重复，扩增产物为各　简单序列重复间的ＤＮＡ片段。　４．２．２双引物ＰＣＲ技术通过特异的双引物选择扩增　基因组ＤＮＡ或基因组ＤＮＡ限制性酶切片段，产生扩增　使用引物的特点可概括为两种类型。　４．２．１单引物ＰＣＲ技术　以一寡聚核苷酸序列（４～　２０ｂｐ）为引物，对基因组ＤＮＡ进行随机ＰＣＲ扩增，产生　扩增片段长度多态。包括ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍｌｙ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ），ＤＡＦ（ＤＮＡ　ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ—　ｉｎｇ），ＳＰＡＲ（ｓｉｎｇｌｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ），ＳＳＲ—　Ａｎｃｈｏｒｄ—ＰＣＲ（ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ—ａｎｃｈｏｒｄ—　ＰＣＲ）等。这些标记与ＲＦＬＰ相比，操作简便，自动化程　度高，但稳定性稍差（吴俊２００２）。ＲＡＰＤ、ＤＡＦ、ＡＰ—　ＰＣＲ标记其技术流程大同小异，即用单引物扩增基因组　ＤＮＡ，ＰＣＲ结束后电泳分析，在紫外光下观察或照像，不　同之处在于所应用的引物类型不同。ＲＡＰＤ标记技术：　ＲＡＰＤ即随机扩增多态ＤＮＡ标记，由ＷｉＩＩｉａｎ１Ｓ等　（１９９０）研究小组建立，是一种以ＰＣＲ技术即多聚酶链式　反应为基础的分子标记，其基本原理是以一个通常为　１０ｂｐ的寡聚核苷酸为引物，通过ＰＣＲ扩增反应，产生不　连续的ＤＮＡ产物，用以检测ＤＮＡ序列的多态性。　一　ｇａｒｅｖａ等（１９９９）利用ＲＡＰＤ技术对Ｃａｍｅｌｉｎａ　ｓａｔｉｗａ和　ｒａｐｉｄ－－ｃｙｃｌｉｎｇ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏＺｅｒａｃｅａ原生质体融合获得的体　细胞杂种进行了分析．其中７个杂种的谱带中具有双亲　的谱带。ＲＡＰＤ技术优点：①引物无种属特异性；②模　板用量极少，灵敏度高；③标记计数量多；④分析自动　化，技术方便快捷，实验成本低，使用范围广。但ＲＡＰＤ　技术的稳定性较差，ＰＣＲ反应对反应条件极为敏感，反　应条件的细微变化可能影响扩增结果的重复性；ＲＡＰＤ　技术通用性差，物种对ＰＣＲ的反应条件不同。ＤＡＦ标　记技术：ＤＮＡ扩增指纹由Ｃａｅｔａｎｏ－－Ａｎｏｌｌｅｓ等（１９９１）建　立。ＤＡＦ所用引物长度比ＲＡＰＤｓ短，甚至可短至５ｂｐ，　因此它所提供的谱带信息比ＲＡＰＤｓ大得多。ＤＮＡ指　纹图谱是指某一品种具有的区别于其他品种的特异　ＤＮＡ片段，其表现方式为一系列电泳图谱的差异。Ｗｕ　等（２００５）运用ＤＡＦ标记技术对初步鉴定为多倍体的杂　种进行了分析，证实了杂种细胞中确实存在双亲的　ＤＮＡ。各品种的ＤＮＡ指纹差异可直接提供与目标性状　有关的ＤＮＡ水平的信息，避免了环境干扰；不受生长发　育时间的制约；成本低且准确可靠。ＡＰ—ＰＣＲ标记技　术：任意引物ＰＣＲ，由ｗｅｌｓｈ和Ｍｃｃｌｅｌｌａｎｄ（１９９０）建立。　ＡＰ－－ＰＣＲ使用的引物较长（１Ｏ～１５　ｂｐ），但ＰＣＲ反应前　２个循环的严谨条件较低，最终的反应结果与ＲＡＰＤ类　似。ＳＳＲ—Ａｎｃｈｏｒｅｄ－－ＰＣＲ：ＳＳＲ锚定ＰＣＲ标记系统由　Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等（１９９４）建立，其技术要点是引物设计时，在　引物的３　ｒ端或５　端锚定上简单序列重复（３ｔ其是（ＣＡ）　ｎ），另一端再设计２～４个碱基；用这种引物扩增ＤＮＡ，　片段长度多态。包括ＳＴＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｔａｇｇｅｄ　ｓｉｔｅｓ），　ＳＣＡＲ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ），ＡＦＬＰ　（ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ），ＳＲＡＰ（ｓｅ—　ｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ），ＴＲＡＰ（ｔａｒｇｅｔ　ｒｅｇｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ－－ｉｓｍ）。这类标记为共显性，　多态性高，分辨率高，稳定性强，重复性好，速度快，自　动化程度高。ＳＴＳ标记技术：序列赤志位点是基于　ＲＦＬＰ发展起来的一类ＰＣＲ标记技术。ＳＴＳ技术的基　本原理是：对ＲＦＬＰ标记使用的克隆进行测序，根据序　列信息设计一对引物，用于对基因组ＤＮＡ进行特意扩　增，对扩增产物进行常规的ＤＮＡ电泳检测扩增产物的　多态性。甘蓝型油菜与花椰菜原生质体通过ＰＥＧ法诱　导融合，采用ＳＴＳ标记引物鉴定３２株再生植株为杂种。　（惠志明等２００６）。ＳＴＳ作为一种基于ＰＣＲ的标记技　术，显然具有ＲＦＬＰ无法比拟的实用性。ＳＣＡＲ标记技　术：ＳＣＡＲ标记技术由Ｐａｒａｎ和Ｍｉｃｈｅｍｏｒｅ（１９９３）建立，　其原理是将一个理想的ＲＡＰＤ标记克隆后，对其末端进　行测序，而后设计出较长的引物（如２４个碱基），对不同　材料中该标记的有无进行特异扩增。这样，不同材料中　ＤＮＡ序列的差异可通过这个单一带的出现与否加以判　断。李映等（２００５）利用两个ＳＣＡＲ双侧翼标记对马铃　薯四倍体栽培种的双单倍体系与二倍体野生种的原生　质体融合体细胞杂种进行分子标记辅助鉴定。ＳＣＡＲ的　稳定性比ＲＡＰＤ增强了许多，而且待检ＤＮＡ间的差异　可直接通过有无扩增产物来显示，这甚至可省去电泳的　步骤。ＡＦＬＰ标记技术：ＡＦＬＰ扩增片段长度多态性。　该标记系统由Ｚａｂｅａｕ和Ｖｏｓ（１９９５）发明，其原理是选择　性扩增基因组ＤＮＡ的酶切片断。由于不同材料的　ＤＮＡ的酶切片断存在差异，因而便产生了扩增产物的　多态性。利用ＡＦＬＰ技术对Ｔｈｌａｓｐｉ　ｃａｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ和　Ｂｒａｓｓｉｃａ　Ｈ￣ｌｐｌ，ｌＳ原生质体融合获得的体细胞杂种进行了　分析，发现１７个植株都具有１Ｏ个以上的双亲的特征谱　带，属于双亲融合的体细胞杂种（Ｂｒｅｗｅｒ，１９９９）。ＡＦＬＰ　技术与ＲＡＰＤ技术相比有以下优点：①显性标记，多态　性强；②稳定性好，分辨率高，重复性强，可靠性好。但　是其实验程序比ＲＡＰＤ技术复杂；需使用同位素等标记　引物，成本高，对人体有害。ＳＲＡＰ标记技术：相关序列　扩增多态性是一种新型的基于ＰＣＲ的标记系统，由美国　加州大学蔬菜作物系Ｉ』与Ｑｕｉｒｏｓ（２００１）提出，也称基于　５７　维普资讯 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・专题综述・　序列扩增多态性（ＦＥＲＲＩＯＩ　和ＰＩＣＯ　２００３）。ＳＲＡＰ的　原理是利用独特的引物设计对ＯＲＦｓ（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅｓ，开放阅读框架）进行扩增，上游引物长１７ｂｐ，５　端　的前１０　ｂｐ是一段填充序列，紧接着是ＣＣＣ，Ｇ，它们组成　核心序列及３　端３个选择碱基，对外显子进行特异扩　增。下游引物长ｌ８　ｂｐ，５　端的前１０￣１１　ｂｐ是一段填充　序列，紧接着是ＡＫＫＩ＂，它们组成核心序列及３　端３个　选择碱基，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增，因　个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而　产生多态性。陆地棉品种Ｃｏｋｅｒ　２０１和克劳茨基棉通过　对称融合获得体细胞杂种。采用ＳＲＡＰ标记检测再生　植株中含有双亲的特征带，证明了杂种的真实性（张献　龙等，２００４）。相关序列扩增多态性是近年来发展起来的　一种新型分子标记系统，它具有简便、中等产量、高共显　性、重复性、易于分离条带及测序等优点，最大的特点是　它针对的是基因的阅读框区域。ＴＲＡＰ标记技术：靶位　区域扩增多态性是基于ＰＣＲ的新型标记系统，由ｔｔｕ与　Ｖｉｃｋ（２００３）提出。与ＳＲＡＰ、ＲＡＰＩ）和ＡＦｔ　等标记技　术无须任何序列信息即可直接ＰＣＲ扩增不同，ＴＲＡＰ技　术是基于已知的ｃＤＮＡ或ＫｑＴ序列信息。其原理是利　用生物信息学工具和表达序列标签（ＥＳＴ）数据库信息，　产生目标候选基因区多态性标记。该技术采用２个ｌ８　核苷酸引物，一个为固定弓ｌ物，依据ＫＳＴ序列设计；另一　个为随机引物，针对外显子或内含子的特点，设计分别　富含ＧＣ或ＡＴ核心区的任意序列。通过对目标区域　ＰＣＲ扩增，产生围绕目标候选基因序列的多态性标记。　ＳＲＡＰ与ＴＲＡＰ是最近发展的新型分子标记系统，具有　简便、高效、重复性好等优点，作为遗传标记在作物体细　胞杂种的鉴定中有着广阔的前景。　４．３以重复序列为基础的分子标记　以重复序列设计出的双引物对重复序列及其间的　序列进行扩增，产生扩增片段长度多态。包括ＳｓＲ　（ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ），５Ｓ　ｒＤＮＡ间隔序列分析、ＩＳＳＲ　（ｉｎｔｅｒ—Ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａ１）。这类标记为共显性，　多态性很高，稳定。　４．３．１　ＳＳＲ标记技术　ＳｘＳＲ，由Ｒａｆａｌｓｈｉ和Ｔｉｎｇｅｙ　（１９９３）提出。ＳＳＲ即简单重复序列，短串联重复或称简　单序列长度多态性，它是由基因组中的二核苷酸、三核　苷酸和四核苷酸的简单串联重复Ｉ）ＮＡ序列。ＳＳＲ的标　记属于共显性标记，符合孟德尔方式的分离和遗传规　律；标记的数量是无限的；每个位点上有许多等位形式；　带型简单，客观明了；既可用于探针，又能通过ＰＣＲ　－Ｒ速　扩增（马义勇和李殿申，２００５）。运用ＫｑＲ标记技术对胡　萝卜和川西獐牙菜体细胞杂种的叶绿体ＤＮＡ分析表　明，杂种细胞中双亲叶绿体基因组随机分离并发生重组　（李子东等，２００５）。　５８　北方园艺２００７（１２）：５５～５９　４．３．２　５ＳｒＤＮＡ间隔序列分析５ＳｒＤＮＡ在至今研究　的所有真核生物中是以串联重复单位组成的，属简单多　基因家族，１２０　ｂｐ的编码区之间是随不同生物而长度不　同的非转录间隔区。高等植物的间隔序列长度在９Ｏ～　４００　ｂｐ之间，同一属的不同种植物之间以及同一种植物　之间间隔序列的碱基序列和长度不同。以保守的５Ｓ　ｒＤＮＡ编码区的一致序列为基础设计ＰＣＲ引物，用来选　择性扩增变异较大的非转录间隔区，以区别融合双方的　核基因组，据此可进行体细胞杂种的鉴定。Ｃｈｅｎｇ等　（２００４）曾运用５Ｓ　ｒＤＮＡ间隔序列分析对Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉ－　ｍ　Ｉ　和Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｅｌｏｇａｔｕｍ的体细胞再生植株和愈伤　组织进行鉴定。５Ｓ　ｒＤＮＡ间隔序列分析操作方便，重复性　好，在生长发育的各个时期均能检测，所需ＤＮＡ量少，是　一种分子水平上鉴定体细胞杂种的好方法。但由于此法　检测的基因组位点数目较少，可与其它的分子检测技术如　ＲＡＰＤ、ＲＦＬＰ等相结合，对体细胞杂种中的异源基因作出　更精确、更全面的定位与分析（周爱芬等，１９９０）。　４．３．３　ＩＳＳＲ标记技术ＩＳＳＲ利用植物基因组中常出　现的ＳＳＲ序列本身设计引物，无需克隆和测序。ＩＳＳＲ　引物通常是一段长度在１５－－２０ｂｐ左右的一段简单重复　序列，扩增产物则为满足扩增子的ＳＳＲ之间的ＤＮＡ区　域。Ｒｅｄｂｌｕｓｈ和Ｄｕｎｃａｎ　ｇｒａｐｅｆｒｕｉｔ的原生质体对称融　合得到了再生植株，采用不同的引物运用ＩＳＳＲ标记技　术鉴定它的本质（Ｓｅａｒａｎｏ等，２００２）。　４．４以单核苷酸为基础的分子标记　同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几　个核苷酸的差异，因此在分子水平上对单个核苷酸的差　异进行检测是很有意义的。目前ＳＮＰ作为一种新的分　子标记，已有２　０００多个标记定位于人类染色体上，在植　物上也在进行开发研究。　５讨论　理想的遗传标记应具备多态性高、重复性高、稳定　遗传、能检测整个基因组、不受内外环境的影响、操作经　济等特征。相比之下，形态学标记、细胞学标记和生化　标记的多态性较低、信息量小，它们都是以基因表达的　结果为基础，是对基因的间接反映，而基因表达过程本　身包含着内外环境与基因之间的相互作用。ＤＮＡ分子　标记是ＤＮＡ水平上遗传变异的直接反映，它们是最能　稳定遗传的，且可遍及整个基因组。因此，ＤＮＡ分子标　记具有信息量大，多态性高，许多多态性标记在非编码　区，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁　遗传现象，不受内外环境（组织类别、发育时期等）的干　扰，与基因表达与否无关，检测迅速，操作简便等优点。　ＤＮＡ分子标记是目前最为理想的分子标记，被广泛应　用于作物杂种的研究中。　然而，ＤＮＡ分子标记技术本身也存在着缺点和不　维普资讯 http://www.cqvip.com

北方园艺２００７（１２￣一５～５９　足，如各类分子标记的应用很不平衡，以ＲＡＰＤ为最多，　ＲＦ【Ｊ）其次，ＡＦＬＰ最少。而ＲＡＰＤ技术本身不稳定，只　有转化为Ｓ　ｒｓ或ＳＣＡＲ才能应用。随着分子生物学的　发展，ＤＮＡ分子标记将在作物杂种研究上取得更加长　ｐｈｙｔｉａ，２００５，１４１（３）：２２９—２３５．ｃ　・专题综述・　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｆｕｓｉｏｎ　ｆｏｒ　ｓｅｅｄｌｅｓｓ　ｔｉｒｐｌｏｉｄ　Ｃｉｔｒｕｓ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｅｕ—　［１４］ｗｅｌｓｈ　Ｊ，Ｍｅｃｌｅｌｌａｎｄ＾，Ｌ　Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲ　ｗｉｔｈ　ａｒｂｉ—　ｔｒａｒｙ　ｐｒｉｍｅｒｓ［Ｊ］．Ｎｕｄｅｉｃ　ＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９０，１８：７２１３—７２１８．　［１５］Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ　Ｅ，Ｒａｆａｌｓｋｉ　Ａ，Ｌａｂｕｄａ　ｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｉｔｉｎｇ　ｂｙ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ）ａｎｃｈｏｒｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ～ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉａｔｉｃｏｎ　足的进步，使种质资源的研究、分子遗传图谱的构建日　趋成熟，使遗传群体、基因标记以及基因文库得到充分　利用，使绝大多数性状基因得到准确定位，并利用图位　［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９４，２０：１７６—１８３．　［１６］Ｇｕｐｔａ　Ｍ，Ｃｈｙｉ　Ｙ　Ｓ，Ｒｏｍｅｒｏ－Ｓｅｖｅｒｓｏｎ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ａｍｐｌｉｆｉａｔｉｃｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｒｏｍｅ　ｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ　ｉｖｅｒｄｓｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｕｓｉｎｇ　ｓｉｎｇｌｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｏｆ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅ—　克隆技术克隆重要性状基因，加快作物遗传学研究和遗　传改良的进程。　参考文献　［１］陈春丽，郭文武，邓秀新．染色体原位杂交技术与植物体细胞杂种遗　传鉴定［Ｊ］．华中农业大学学报，２００２，２１（２）：１８９—１９４．　［２］张列，曹家树．染色体原位杂交技术［Ｊ］．植物生理学通讯，２０００，３６　（６）：５４４　５４９．　ｑｕｕｅｎｃｃ　ｒｅｐｅａｔｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｒｏ．Ａｐｐ１．Ｇｅｎｃｔ，１９９４，８９：９９８—１００６．　［１７］惠志明，刘凡，简元才，等．原生质体非对称融合获得花椰菜与Ｏｇｕ　ＣＭＳ甘蓝型油菜种问杂种［Ｊ］．华北农学报，２００６，２１（３）；６５—７０．　［１８３　Ｐａｒａｎ　Ｉ，Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ　Ｒ、ｖ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｌｉｎｋｅｄ　ｔｏ　ｄｏｗｎｙ　ｍｉｌｄｅｗ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｌｅｔｔｕｃｅ［Ｊ］．Ｔｈｅｒｏ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ，　１９９３，８５：９８５—９９３．　［１９］李映，蔡兴奎，李林章，等．马铃薯体细胞杂种的青枯病抗性鉴定［Ｊ］．　中国马铃薯，２００５，１９（４）：１９８—２００．　［３］Ｉｔｏｈ　Ｋ，１ｗａｂｕｅｈｉ　Ｍ，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ　Ｋ　Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｓｐｅｄｅｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅｓ　ｇｉｖｅｓ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　ｎａｔｕｒｅｏｆ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｈｙｂｒｉｄｓ　Ｅ２０］ＶｏｓＰ，ＨｏｇｅｒｓＲ，ＢｌｅｅｋｅｒＭ，ｅｔ　ａ１．．ＡＦＬＰ：Ａ　ｎｅｗｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒＤＮＡ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎ－ｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ，１９９５，２３：４４０７—　４４１４．　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｘ—ｒａｙ　ｆｕｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ，１９９１，８１：３５６—３６２．　［４］Ｗａｎｇ　Ｊ，Ｘｉａｎｇ　Ｆ　Ｎ，Ｘｉａ　Ｇ　Ｍ　Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ　ｃｈｒｏｍａｔｔｉｎ　ｌｏｃａｌｉ—　ｚａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｗｈｅａｔ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ｉｎ　ａｎ　ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｉｎｅ［Ｊ］．ｐｌａｎｔａ（Ｂｅｒｌｉｎ），　２００５，２２１（２）：２７７－２８６．　［２１］Ｂｒｅｗｅｒ　Ｅ　Ｐ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ　Ｊ　Ａ，Ａｎｇｌｅ　Ｊ．Ｓｃｏｔｔ，ｅｔ　ａ１．Ｓｏｍａｔｉｃ　ｈｙｂｒｉｉｄｚａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｚｉｎｃ　ａｅｃｕｍｕｌａｔｏｒ　Ｔｈｌａｓｐｉ　ｆｉｌｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ａｎｄ　Ｂｒａｓｓｉａ　ｎａｐｕｓ［Ｊ］．ｃ　Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ，１９９９，９９：７６１—７７１．　［５］Ｗｏｈｅｒｓ　Ａ　Ｍ　Ａ，Ｓｃｈｏｅｎｎｍｋｅｒｓ　Ｈ　Ｃ　Ｈ，Ｋａｍｓｔｒａ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｍｉｔｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｍｅｉｏｔｉｃ　ｉｒｒｅｇｕｌａｒｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｈｙｈｒｉｄｓ　ｏｆ　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ　ａｎｄ　ｓｏｌａ—　［２２］ｕ　Ｇ，ＱＵＩＲＯＳ　Ｃ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｄ　ｐｅｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，１９９４，３７：７２６—７３５．　［６］Ｔｒａｂｅｌｓｉ　Ｓ，Ｇａｒｇｏｕｒｉ—Ｂｏｕｚｉｄ　Ｒ，Ｖｅｄｅｌ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．Ｓｏｍａｔｉｃ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ｂｅ—　ｔｗｅｅｎ　ｐｏｔａｔｏ　Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ　Ｓｏｌａｎｕｍ　ｖｅｒｎｅｉｅｘｈｉｂｉｔ　ａ　（ＳＲＡＰ）。Ａ　ｎｅｗｍａｒｋｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｉｔｓ　ａｐｐｌｉａ—ｃ　ｔｉｏｎ　ｔｏ　ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｔａｇｇｉｎｇ　ｉｎ　Ｂ　ｒａｓｓｉａ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌｃ　Ｇｅｎｅ，２００１，　１０３：４５５－４６１．　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｔｏｍｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，　２００５，８３（１）：１－１１．　［２３］ＦＥＲＲＩＯＬ　Ｍ，ＰｌＣＯ　Ｂ，ＮＵＥＺ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ　ｍａｘｉｍａ　ｆｒｏｍ　Ｓｐａｉｎ　ｕｓｉｎｇ　ＲＡＰＤ　ａｎｄ　ＳＢＡＰ　ａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｇｅｍｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｃｒｏｐ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００３，５０（３）：２２７—２３８．　［７］向凤宁，冯保民，夏光敏，等．小麦与高冰草体细胞杂种　代的性状　和蛋白质组分［Ｊ］．植物学报，２００１，４３（３）：２３２—２３７．　ｒ８］Ｃｈｅｎｇ　Ａ　Ｘ，Ｘｉａ　Ｇ　Ｍ，Ｚｈｉ　Ｄ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｆｅｒｔｉｌｅ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓ—　ｔｉｖｕｍ（＋）Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ａｒｅ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｌｏｗ　ｄｏｓｅｓ　［２４３张献龙，孙玉强，吴家和，等．棉花细胞工程及新种质创造［Ｊ］．棉花学　报，２００４，１６（６）：３６８—３７３．　［２５］ＨＵ　Ｊ，ＶＩＣＫＢ八Ｔａｒｇｅｔ　ｒｅｇｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉａｔｉｃｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍａｒｋｅｒ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｃｕｌｅａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔ—　ｅｒ，２００３，２１：２８９－２９４．　。ｆ　ｕＶ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，１４（１）：８６—９１．　［９］吴俊，魏钦平，束怀瑞，等．分子标记及其在果树种质资源研究中的　应用［Ｊ］．安徽农业大学学报，２００２，２９（２）：１５８—１６２．　［ＩＯ３　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｊ　Ｇ　Ｋ，Ｋｕｂｅｌｉｋ　Ａ　Ｒ，Ｌｉｖａｋ　Ｋ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｎｍ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｒｅ　ｕｓｅｆｕｌ　ａｓ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，１８（２２）：６５３１—６５３５．　［２６］Ｒａｆａｌｓｈｉ　Ｊ　Ａ，Ｔｉｎｇｅｙ　Ｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉａｇｎｏｓｔｉｄｃｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｂｒｅｅｄｉｇ：ＲＡＰ—ｎ　Ｄｓ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｌｔｅ　ａｎｄ　ｍａｃｈｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ，１９９３，９：２７５－２７９．　［２７３马义勇，李殿申，玉米分子标记的研究进展［Ｊ］．杂粮作物，２００５，２５　（６）：３５３－３５５．　［１１］Ｓｉｇａｒｅｖａ　Ｍ　Ａ，Ｅａｒｌｅ　Ｅ　ｎ　ＣａｎＭｅｘｉｎ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎｉｎｔｅｒｔｒｉｂａｌｓｏｎｍｔｉｃ　ｈｙ—　［２８］李子东，邵菲，蔡云飞，等．胡萝　与川西獐牙菜不对称体细胞杂种　的核／质基组特征［Ｊ］．植物生理与分子生物学报，２００５，３１（３）；２５４—２６０．　［ｚ９］周爱芬，徐春晖，向风宁，等．应用５ｓ　ｒＤＮＡ间隔序列分析鉴定体细　胞杂种［Ｊ］．生物工程学报，１９９０，１５（１４）：５２９—５３１．　［３０］￥ｃａｒａｎｏ　Ｍ　Ｔ，Ａｂｂａｔｅ　Ｌ，Ｆｅｒｒａｎｔｅ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｔｃｈｎｉｅｑｕｅ：Ａ　ｕｓｅ—　ｆｕｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ　ｎｅｗ　ａｌｌｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ｏｆ　ｍａｎｄａｒｉｎ　ｂｒｉｄｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｃａｍｅｌｉｎａ　ｓａｔｉｖａ　ａｎｄ　ｒａｐｉｄ—ｃｙｃｌｉｎｇ　Ｂｒａｓｓｉａｃ　ｏｌｅｒａｅｅａ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ，１９９９，９８：１６４—１７０．　［１２］Ｃａｅｔａｎｏ－Ａｎｏｌｌｅｓ　Ｄ，Ｂａｓｓａｍ　Ｂ　Ｊ，Ｇｒｅｓｓｈｏｆｆ　Ｐ＾，Ｌ　ＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｉｎｔｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｖｅｒｙ　ｓｈｏｒｔ　ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ　ｔｉｄｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ［Ｊ］．Ｂｉｏ—　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，９：５５３—５５７．　［１３３３　Ｗｕ，Ｊ　Ｈ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ　Ａ　Ｒ，Ｍｏｏｎｅｙ，Ｐａｕｌｉｎｅ八Ａｌｌｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ　ｈｙｂｒｉｄｓ　［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００２，２０（１２）：１１６２—１１６６．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｒｏｐ　ＺＨＡＮＧ　Ｙｕ，ＺＨＡＯ　Ｙｕｎ－ｙｕｎ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｃａｐｉｔａｌ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００３７，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｅｍｐｈａｓｉｚｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｓｏｍａｔ—　ｉｃ　ｈｙｂｒｉｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓｏｍａｔｉｃ　ｈｙｂｒｉｄ；Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｒｋｅｒｓ　５９