鸡新城疫病毒不同浓缩方法的比较

《上海畜牧兽医通讯》２００８年第１期　・２３・　鸡新城疫病毒不同浓缩方法的比较　孙玉霜　蒙晓蕾　张立新　刘长辉　（天津市禽病诊断培训中心病毒的浓缩与纯化是病毒分子生物学和生物制品研究　３００４０２）　１％ＨＣＩ调整使其ｐＨ值为６．４；第二组尿囊液本身，其ｐＨ值　为７．Ｏ，不需要调整；第三组用１％ＮａＨＣＯ　调整，使其ｐＨ值　的主要内容，也是疾病诊断的常用技术。超速离心法、密度　梯度离心、超过滤法、层析法等提纯浓缩病毒的效果好，但其　为８．Ｏ，然后每一ｐＨ组的三份分别加入聚乙二醇，使其最终　对设备要求较高，而且操作较为复杂，难以在基层推广应用。　而采用透析袋、红细胞吸附释放法对新城疫病毒进行浓缩、　提纯无需特殊设备，其操作简便，使浓缩后的病毒含量及纯　度有了较大的提高，也便于进行该类病毒病的诊断与研究。　１材料与方法　１．１材料　新城疫病毒Ⅳ系、透析袋、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２磷酸缓冲溶　液）、红细胞１Ｏ％、聚乙二醇（ＰＥＧ＝６０００）等。　１．１．１新城疫病毒液的准备：将Ⅳ系病毒稀释２５０倍于灭　菌的生理盐水中，加入青、链霉素各１万单位／ｍｌ，４＂Ｃ作用　４　ｈ后，接种９日龄鸡胚于３７℃培养，去掉２４　ｈ内死胚，７２　ｈ　后冻死并收集尿囊液，离心（２　０００　ｒ／ｍｉｎ）１０　ｍｉｎ，去掉大的组　织块，留取上清液备用，经测定ＨＩ＝２。　１．１．２　透析袋的准备：取１０　ｃｍ长度的透析袋放于３％　ＮａＣＩ溶液中煮沸３０　ｍｉｎ备用。　１．１．３红细胞的准备：用抗凝剂采集鸡鲜血５　ｍｌ，用ＰＢＳ液　洗涤３次，除去胶原蛋白及其他白细胞等，并用ＰＢＳ液配制　成浓度１Ｏ％的红细胞溶液。　１．１．４聚乙二醇：分为两种：一种是直接放于尿囊液中沉淀　病毒，分三组，第二种是配成４Ｏ％浓度用于透析袋透析浓缩。　１．１．５　ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）：甲液ＮａＨＰＯ４　２１．３　ｇ，ＮａＣＩ　８．５　ｇ，　Ｈ２０加至１　０００　ｍｌ；乙液ＫＨＰＯ４　２０．４２　ｇ，ＮａＣＩ　８．５　ｇ，Ｈ２Ｏ加　至１　０００　ｍｌ。取甲液７２　ｍｌ加入２８　ｍｌ乙液，再加入１００　ｍｌ　水即为ｐＨ＝７．２的磷酸缓冲液。　１．２　方法　将其处理的方法分为四组。　１．２．１红细胞处理组：取新城疫尿囊液１Ｏ　ｍｌ，加入红细胞　（１０％）６．６　ｍｌ使其最终浓度为４％。混合均匀，置人４＂Ｃ冰　箱过夜。其间摇动使充分接触混匀２次。次日离心（２　０００　ｒ／ｍｉｎ）１０　ｍｉｎ弃上清，用Ｏ℃ＰＢＳ冲洗红细胞２次（冰浴中进　行），每次０．５　ｍｉｎ，再离心（２　０００　ｒ／ｍｉｎ）５　ｍｉｎ去上清。并在　沉淀的红细胞中加入原尿囊液体积的１／５０　ＰＢＳ摇匀，放在　３７℃水浴锅内３　ｈ，离心（２　０００　ｒ／ｍｉｎ）１０　ｍｉｎ，吸取上清。再　向红细胞内加入原尿囊液体积的１／１００　ＰＢＳ摇匀继续水浴　保温２　ｈ，离心（２　０００　ｒ／ｒａｉｎ）１０　ｒａｉｎ吸取上清液与上一次上　清液混合。对混合上清液进行血凝素ＨＡ测定。　１．２．２高速离心组：取１Ｏ　ｍｌ尿囊液离心（４　０００　ｒ／ｒａｉｎ）　１０　ｒａｉｎ，吸取上清液，配平衡后，在０～４Ｚ；下，离心（１５　０００　ｒ／ｒａｉｎ）６０　ａｒｉｎ去掉上清液并加入原体积的１／５０　ＰＢＳ重新悬　浮病毒沉淀，并进行血凝素效价滴定。　１．２．３透析袋组：将ｌＯ　ｍｌ尿囊液放人透析袋内，两端扎紧　后放人配制好的４Ｏ％的聚乙二醇中，４Ｚ；冰箱保存２４　ｈ。取　出并加入１／５０原尿囊液体积的ＰＢＳ，并用手指轻轻挤压将　内存的病毒挤到一块。用加样器吸出进行ＨＡ测定。　１．２．４聚乙二醇组：取尿囊液三组，每组三份。第一组用　的浓度为５％、７．５％、１Ｏ％，最后在每份中分别加入１％ＮａＣＩ　２　ｍｌ，放人４Ｚ；冰箱作用２４　ｈ，离心沉淀，去上清，沉淀再用　１／５０体积的ＰＢＳ垂悬，并进行ＨＡ测定。　２　结果　表ｌ试验结果　从表１可以看出，高速离心组达１４　ｌｏｇ２，效果最好浓缩　达５Ｏ倍左右，但需要价格昂贵的高速离心机，其病毒样本浓　缩后的性状也较好。红细胞组和透析袋组均为１２　ｌｏｇ２，浓缩　达３２倍，而从红细胞处理后尿囊液测定得知ＨＡ达２　ｌｏｇ２，　证明病毒并未完全吸附到红细胞上。说明红细胞的处理浓　度还有待于进一步调整，以求得最大的病毒吸附量。透析袋　浓缩后的病毒样本较为粘稠，说明里面有大分子蛋白质及其　他一些脂类物质，如对尿囊液进行去脂类及其他杂蛋白处理　后改进其眼观性状会更好。聚乙二醇法有报道说对法氏囊　等病毒沉淀效果好，但通过我们实验证明对该鸡新城疫病毒　浓缩效果并不理想，有的还会有不同浓度的降低，而且要去　掉沉淀病毒中的聚乙二醇也较为困难。　３讨论　综上所述表明，红细胞浓缩效果好而且特异性强，可应　用于某些具有血凝型病毒的浓缩与提纯。对于试验抗原的　制备及高效价抗体的制备研究提供了简便的方法。透析袋　虽然不能提纯病毒，但经过透析浓缩后可与红细胞浓缩法相　结合，提高浓缩纯度。　用于临床诊断，可采集发病鸡的肺、气管、输卵管等组织　研磨，冻融３次后，离心去沉淀，再用红细胞进行吸附释放来　浓缩病毒，如果ＨＡ达到２　即可进行ＨＩ实验，为区分强弱毒　株，可用单克隆抗体。如仅为一个血凝价，可加双倍量抗原　进行ＨＩ实验，为提高血凝的敏感性，采用Ｏ．５％的红细胞、换　用新的９６孔板即可。如果浓缩后的病毒量很少，可采用红　细胞为载体吸附病毒后固定，再加入相应的荧光抗体，在显　微镜下观察，也会大大提高诊断的准确性与敏感度。　参考文献　［１］韩文瑜，何昭阳，刘玉斌．病原细菌检验技术．吉林科学技术出版　社，１９９２，２２８～２３７　［２］黄祯祥．医学病毒学基础及实验技术．科学出版社，１９８８，２９９～　３０４，５６４　５６５　［３］王世若．间接血凝试验．动物免疫学，１９８８，１９１～１９３　［４］刘宝全．东北农业大学．兽医免疫学，１９９０，１３１～１３３