河北医药２０１０年７月第３２ 第 ３期Ｈｅｂｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊ ２０ Ｑ 』ｕｌ ． ・１６７５ 论著・ 促肝细胞生长素对肾间质纤维化大鼠模型 ＨＧＦ、ＡＬＫ５及ＴＧＦ—ｌ３ １表达的影响 陈丽平 叶凡王保兴刘保良 【摘要】 目的 研究促肝细胞生长素因子（ｐＨＧＦ）对肾间质纤维化大鼠肾组织中肝细胞生长 （ＨＧＦ）、转化生长因子．Ｂ１（ＴＧＦ－１３１）、活化素受体样激酶５（ＡＬＫ５）及胶原Ⅲ的表达的影响，从而探讨促肝 细胞生成素对肾间质纤维化的药物保护机制。方法 ５４只大鼠随机分为：假手术组、单侧输尿管结扎 （ｕｕｏ）组及ｐＨＧＦ治疗组。每组于术后第３、７、１４天分批处死，分别经免疫组化方法测定肾小管间质中 ＨＧＦ、ＴＧＦ．１３１、ＡＬＫ５、胶原Ⅲ的表达的情况，ＨＥ、ＭＡＳＳＯＮ染色评定３组肾小管间质损害程度。结果ＵＵＯ 组ＴＧＦ－１３１、ＡＬＩ（５、胶原Ⅲ的表达及肾小管间质损伤程度明显高于假手术组（Ｐ＜０．０５）；而ｐＨＧＦ治疗组明 显低于ＵＵＯ组（Ｐ＜０．０５）；ＵＵＯ组ＨＧＦ于第３天表达最高，第７天稍有回落，第１４天表达最弱；ｐＨＧＦ治 疗组术后第３天、第７天、第１４天ＨＧＦ的表达均显著高于同时期ＵＵＯ组（Ｐ＜０．０５），肾小管间质病变程 度明显减轻，肾间质相对面积显著减小（Ｐ＜０．０５）。结论质纤维化的程度。 ｐＨＧＦ能有效抑制肾间质中ＴＧＦ一３１１，从而进一 步抑制ＡＬＩ（５的过度表达、使胶原Ⅲ合成减少；同时促进肾间质中ＨＧＦ表达，从而能够改善ＵＵＯ大鼠肾间 【关键词】 肾间质纤维化；肝细胞生长因子；转化生长因子１３１；活化素受体样激酶５；胶原Ⅲ；促肝细 胞生长素 【中图分类号】 Ｒ ６９２．３３ 【文献标识码１ Ａ 【文章编号１ １００２—７３８６（２０１０）１３～１６７５—０４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＧＦ，ＡＬＫ５ ａｎｄ ＴＧＦ一１３１ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｎａｌ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ＣＨＥＮＧ Ｌｉｐｉｎｇ ，ＹＥ Ｆａｎ，ＷＡＮＧ Ｂａｏｘｉｎｇ，ｅｔ ａ１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，Ｔｈｅ Ｈｏ￣ｉｔｄ ｏｆＨｅｂｅ Ｍｅｄ＆ａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｏ＇ｉａｚｈｕａｎｇ ０５００５１， ｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ（ｐＨＧＦ）ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＧＦ，ＡＬＫ５，ＴＧＦ－１３１ ａｎｄ ｃｏ ｍ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｎａｌ ｉｎｔｅｓｔｒｉｔｉａｌ ｉｆｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐＨＧＦ ｏｎ ｒｅｎａｌ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５４ ｍａｌｅ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ３ ｇｒｏｕｐｓ：ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｒｏｕｐ，ＵＵＯ ｇｇｒｏｕｐ，ＵＵＯ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＨＧＦ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ｐＨＧＦ）ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｋｉｌｌｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ３，７，１４ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｓｕ￣ｅｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＨＧＦ，ＴＧＦ一３１１，ＡＬＫ５，ＣｏｌＩＩ１ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｙ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｋｉｄｎｅｙ ｔｕｂｕｌｅｓ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｌａ ｔｉｓｓｕｅ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ＨＥ ｓｔａｉｎ ａｎｄ Ｍａｓｓｏｎ ｓｔａｉｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＴＧＦ一１３１，ＡＬＫ５，Ｃｏ ｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｙ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｋｉｄｎｅｙ ｔｕｂｕｌｅｓ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｌａ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ＵＵＯ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ，ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜ ０．０５）．Ｔｈｅ ｐＨＧＦ ｇｒｏｕｐ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ一３１１，ＡＬＫ５ ａｎｄ Ｃｏｍ（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎ ＵＵＯ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＧＦ ｗａｓ ｔｈｅ ｈＪ ｇｈｅｓｔ ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｈｒｅｅ ｄａｙｓ，ｗｈｉｃｈ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｏｎ ｓｅｖｅｎ ｄａｙｓ ａｎｄ ｗａｓ ｔｈｅ ｗｅａｋｅｓｔ ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｓｔｒ １４ ｄａｙｓ，ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｉｎ ＵＵＯ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＧＦ ｉｎ ｐＨＧＦ ｇｒｏｕｐ ａｆｔｅｒ ３ ｄａｙｓ，７ ｄａｙｓ，１４ ｄａｙｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ＵＵＯ ｒｏｕｐ（Ｐ＜０．ｇ０５），ｎｄ ａｔｈｅ ｉｎｊｕｒｙ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｋｉｄｎｅｙ ｔｕｂｕｌｅｓ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｌａ ｔｉｓｓｕｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｒｅｌｉｅｖｅｄ，ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｉｎ ＵＵＯ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｐＨＧＦ ｃａｌｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ一１３１．ＡＬＫ５ ａｎｄ ＣｏⅢｉｎ ｒｅｎａｌ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｕｍ ｏｆ ＵＵＯ ｒａｔｓ，ａｎｄ ＨＧＦ ｐｌａｙｓ ａｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｔｈｅ ｐＨＧＦ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｃａｎ ｌｉｇｈｔｅｎ ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｕｍ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】ｒｅｎａｌ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｌａ ｉｆｂｒｏｓｉｓ；ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｒｏｗｔｇｈ ｆａｃｔｏｒ；ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ—ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ ５；ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｒｏｗｇｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａｌ；ｃｏｌｌａｇｅｎⅢ；ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ—ｐｒｏｐｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ 肾间质纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病发展的最终结果， 作者单位：０５００５１石家庄市，河北医科大学第三医院药剂科（陈 丽平、刘保良），肾内科（叶凡、王保兴） 是导致慢性肾衰竭的主要原因之一。因此对肾间质纤维化发 病机制的研究及对患者更有效的治疗措施的探索具有重要意 义。转化生长因子一ｐ（ＴＧＦ・ｐ）是一种重要的强效致纤维化因 子，它参与了肾间质纤维化的各个环节。活化素受体样激酶５ （ＡＬＫ５）是ＴＧＦ一３１１型受体的一种，活化的ＴＧＦ—Ｂ使ＡＬＫ５磷酸 通讯作者：王保兴，０５００５１河北医科大学第三医院肾内科； Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｂｉｎｇ＠ｒｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｎ １６７６ 阿北医药２０１０年７月第３２卷第ｌ３期Ｈｅｂｅｉ ＭｅｄｉｃＭ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１０，Ｖｏｌ ３２ Ｊｕｌ Ｎｏ．１３ 化而激活，激活的ＡＬＫ５可以磷酸化其下游的信号分子一受体活 化的Ｓｍａｄ２和Ｓｍａｄ３，从而启动细胞内级联反应，促进ＰＡＩ一１和 间质纤维化，几乎全部肾小管扩张…。 １．６免疫组化染色ＡＬＫ５染色采用ｓＰ法；实验中阳性对照 Ⅲ型胶原基因的表达，进而使细胞外基质合成增加而降解减 少，从而促进肾问质纤维化的发生和发展。而肝细胞生长因子 （ＨＧＦ）是一种重要的抗纤维化因子，对于肾损伤后肾小管的修 复与再生至关重要。本实验以单侧输尿管结扎（ｕｎｉｌａｔｅｒＭ ｕｒｅｔｅｒＨ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＵＵＯ）大鼠模型为研究对象，观察。肾脏组织病 理改变，并应用免疫组织化学方法检测ＨＧＦ、ＴＧＦ．８１、ＡＬＫ５、胶 原Ⅲ的表达情况，同时应用促肝细胞生长素（ｐＨＧＦ）进行干预， 用已知阳性标本，用１％ＢＳＡ代替一抗作阴性对照，镜下观察结 果，阳性部位为棕黄色。ＴＧＦ—Ｂ１、ＨＧＦ染色采用改良卵白素一生 物素一过氧化酶（ＡＢＣ）法；实验中阳性对照用已知阳性标本，用 ＰＢＳ代替一抗作阴性对照，镜下观察结果，阳性部位为棕黄色。 １．７免疫组织化学结果的半定量分析用已知阳性的标本作 阳性对照，采用１％小牛血清白蛋白代替一抗的组织切片作阴 性对照。北京航空航天大学图像中心Ｖ４．０多功能真彩色医学 探讨肾问质纤维化中ＨＧＦ、ＴＧＦ—Ｂ１、ＡＬＫ５、胶原Ⅲ的表达变化 及ｐＨＧＦ对其影响，从细胞因子水平探讨ｐＨＧＦ抗肾间质纤维 化，延缓肾脏病变进展、保护肾功能的机制。 １材料与方法 １．１ 实验动物 清洁级健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠５４只，体重 （２００±１０）ｇ，购自河北医科大学实验动物中心。随机分为假 手术组（Ａ组）、ＵＵＯ组（Ｂ组）和ｐＨＧＦ干预组（Ｃ组），每组１８ 只。每组因于术后第３、７、１４天分批处死而分为Ｎ３、Ｎ７、Ｎ１４ 组，每组６只。 １．２试剂兔抗大鼠ＡＬＫ５单克隆抗体、兔抗大鼠ＨＧＦ单克 隆抗体及兔抗大鼠ＴＧＦ－Ｂ１单克隆抗体购自北京博奥森生物技 术有限公司；兔抗大鼠胶原Ⅲ多克隆抗体购自武汉博士德公 司；注射用ｐＨＧＦ：由广州阳江制药厂有限公司提供。 １．３ 动物模型建立、给药 将３组大鼠以水合氯醛 （０．１ ｍｌ／ｋｇ）经腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于手术台上，剪乇 并消毒腹部皮肤，行左侧耻骨上切口，逐层切开皮肤、肌肉及腹 壁各层，暴露并分离左侧输尿管，沿左肾下极寻找到左输尿管， 于中上１／３处用４号线上下结扎两处，然后从中剪断输尿管， 以防逆行性感染。Ａ组除不结扎和剪断输尿管外，其他手术过 程同前。给药方法：Ａ组和Ｂ组用０．９％氯化钠溶液２ ｍｌ腹腔 注射，１次／ｄ；Ｃ组以促肝细胞生长素０．５ ｍｇ・ｋｇ～・ｄ ）腹腔 注射（约２ ｍ１），１次／ｄ。３组均于术前１ ｄ开始注射至术后第 ３、７和１４天。试验期间３组大鼠自由进水，标准饮食。 １．４标本收集分别于输尿管结扎术后第３、７、１４天随机选 取３组６只大鼠断头处死，快速取出左肾，去掉包膜，按冠状位 纵行剖开，取肾组织的１／２置于１０％中性甲醛固定液固定， ４８ ｈ后行石蜡包埋，后将肾组织切成５ ｍ切片，拟行ＨＥ、Ｍａｓ— ｓｏｎ及免疫组织化学染色。 １．５肾组织病理学检查（ＨＥ、Ｍａｓｓｏｎ染色）ＨＥ染色观察切 片中肾小管间质的病变程度，应用北京航空航天大学图像中心 Ｖ４．０多功能真彩色医学图像系统，通过光学显微镜摄入图像， 放大２００倍，对图像进行灰度交换后，将阳性染色与背景分开， 进行自动检测。在高倍镜下（Ｘ ２００）随机选取ｌ０个不含肾小 球的皮质视野，计算肾间质面积与肾小管间质面积的比值（面 密度），取其平均值为每例切片的肾问质相对面积。Ｍａｓｓｏｎ染 色观察切片中肾间质纤维化的程度，采用单盲方法，进行半定 量分析，绿色为胶原纤维，分级如下：０级，正常肾小管没有纤维 化；＋级，轻微肾问质纤维化，几乎正常的肾小管；＋＋级，比较 严重的肾间质纤维化伴有。肾小管的扩张；＋＋＋级，显著的肾 图像系统通过光学显微镜摄人图像，放大２００倍，计算每例切 片肾小管问质１０个不重叠的２００倍视野中ＴＧＦ—Ｂ１、ＡＬＫ５、 ＨＧＦ阳性染色面积与染色强弱相结合的平均值，计算平均积分 光密度。最后根据３组的均值作比较。 １．８统计学分析应用ＳＰＳＳ １１．５统计软件，计量资料以 ±ｓ 表示，采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 ２结果 ２．１ ２组大鼠肾组织病理变化ＨＥ染色各期Ａ组大鼠肾组 织未见明显异常变化。Ｂ组大鼠于术后第３天出现肾小管轻 度扩张，可见肾间质中少量单核细胞和淋巴细胞浸润，肾间质 宽度增加；第７天可见肾小管扩张，肾间质可见大量单核细胞 和淋巴细胞浸润，间质宽度明显增加，并可见肾小管上皮细胞 变性、水肿、甚至坏死，偶见萎缩肾小管；第１４天上述病变加 重，可见弥漫的肾小管基底膜增厚皱缩，间质中淋巴细胞和单 核细胞浸润，纤维化较明显，与同期Ａ组比较，Ｂ、Ｃ组肾问质相 对面积明显增加，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。与同期Ｂ 组相比，Ｃ组大鼠肾小管间质病变程度明显减轻，肾间质相对 面积明显减少（Ｐ＜０．０５）。Ｍａｓｓｏｎ染色Ａ组大鼠肾组织未见 明显异常。Ｂ组大鼠于术后第３天出现肾小管扩张，肾问质胶 原纤维增加，染色加深；第７、１４天病变进一步加重，与同期Ａ 组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。Ｃ组与同期Ｂ组相比， 。肾小管扩张、肾间质增宽程度及肾小管间质的纤维化程度均有 明显下降（Ｐ＜０．０５），但仍高于同期Ａ组（Ｐ＜０．０５）。见表 １、２ 表１ ３组肾间质相对面积 ｎ＝１８，ｉ±ｓ 注：与Ａ组比较， Ｐ＜０ ０５；与Ｂ组比较， Ｐ＜０．０５；与第３天比较，ａｐ＜ ０．０５：与第７天比较， Ｐ＜Ｏ．０５ 表２ ３组肾间质纤维化结果半定量分析 ｎ＝１８，只（％） 注：与Ａ组比较， Ｐ＜Ｏ ０５；与Ｂ组比较， ＜０．ｏ５ ２．２免疫组化染色结果 ２．２．１ ＨＧＦ表达的变化：ＨＧＦ在Ａ组各时期的肾组织中几乎 河北医药２０１０年７月第３２卷第１３期Ｈｅｂｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎ￣２Ｑ ， ０ｌ 』 ！ ： 表６胶原Ⅲ免疫组化结果 １６７７ 无表达。Ｂ组大鼠ＨＧＦ主要表达于肾小管上皮细胞，术后第３ 天可见肾间质中ＨＧＦ的表达最多，且随着梗阻时问延长，这种 表达也逐渐降低，第７天表达回落，于术后第１４天的表达最 ｎ＝１８，ｉ±ｓ 弱，但均高于同期Ａ组（Ｐ＜０．０５），且３组肾小球内表达无明 显变化。与同期Ｂ组相比，Ｃ组则可升高同一时点的ＨＧＦ在 肾小管上皮细胞及肾间质中的表达（Ｐ＜０．０５），随着时间延 长，ＨＧＦ的表达逐渐减弱，但均高于同期Ａ组（Ｐ＜０．０５）。见 表３，图１、２。 表３ ＨＧＦ免疫组化结果 ｎ：１８，ｉ±ｓ 注：与Ａ组比较， Ｐ＜Ｏ．０５；与Ｂ组比较，带Ｐ＜０．０５；与第３天比较， Ｐ‘ ０．０５；与第７天比较， Ｐ＜０．０５ ２．２．２ ＴＧＦ一６１表达的变化：Ａ组大鼠肾组织ＴＧＦ一６１主要在 肾小管上皮细胞胞浆中表达，肾间质、肾小球微量表达。Ｂ组 大鼠术后第３天ＴＧＦ一６１的表达较Ａ组明显增多，随着梗阻时 间的延长，变化更为明显，术后第１４天ＴＧＦ一６１表达最强，与同 期Ａ组比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。与同期Ｂ组比 较，ｃ组可降低同一时点的ＴＧＦ一６１在肾间质的表达（Ｐ＜ ０．０５），随着时间延长，ＴＧＦ一６１的表达也逐渐增多。见表４， 图３、４。 表４ ＴＧＦ一６１免疫组化结果 ｎ＝１８， ±ｓ 注：与Ａ组比较， Ｐ＜０．０５；与Ｂ组比较， ＜０．０５；与第３天比较， Ｐ ０．０５；与第７天比较， Ｐ＜０．０５ ２．２．３ ＡＬＫ５表达的变化：Ａ组大鼠肾组织ＡＬＫ５未见明显表 达。Ｂ组大鼠ＡＬＫ５主要表达于肾小管及肾间质，与同期Ａ组 相比，Ｂ组大鼠于术后第３天时出现ＡＬＫ５表达进行性升高（Ｐ ＜０．０５），且随着梗阻时间的延长，表达明显增多，于手术后第 ｌ４天表达最强。与同期Ｂ组相比，Ｃ组可降低同一时点的 ＡＬＫ５在肾间质的表达（Ｐ＜０．０５），随着时间延长，ＡＬＫ５的表 达也逐渐增多。见表５，图５、６。 表５ ＡＬＫ５免疫组化结果 ｎ：１８，ｉ± 注：与Ａ组比较， Ｐ＜０．０５；与Ｂ组比较， ＜０．０５ ２．２．４胶原Ⅲ表达的动态变化：Ａ组大鼠肾组织中未见胶原 Ⅲ的阳性染色的明显变化，仅在肾小管间质区域见到少量胶原 Ⅲ的表达。Ｂ组大鼠肾间质中胶原Ⅲ的表达在术后第３天开 始增多，且随着时间的延长，其表达也逐渐增强，于术后第１４ 天为最强，且３组肾小球内的表达无明显变化。Ｃ组则可降低 同一时点的胶原Ⅲ在肾间质中的表达（Ｐ＜０．０５），随着时间的 延长，胶原Ⅲ的表达也逐渐增强，且Ｂ、Ｃ组差异有统计学意义 （Ｐ＞０．０５）。见表６，图７、８。 注：与Ａ组比较， Ｐ＜０．０５；与Ｂ组比较，Ｓｐ＜０．０５ 图ｌ Ｂ组第ｌ４天ＨＧＦ，可 图２ Ｃ组第ｌ４天ＨＧＦ，与 见ＨＧＦ在肾小管上 Ｂ组同时相点比较 皮细胞胞浆中表达很 ＨＧＦ在肾小管上皮细 弱，肾问质微量表达 胞胞浆中表达明显增 （免疫组化ｘ２００） 强，肾间质表达也增 多（免疫组化×２００） 图３ Ｂ组第１４天ＴＧＦ－Ｂ１， 图４ Ｃ组第１４天ＴＧＦ・Ｂ１， 可见ＴＧＦ－Ｂ１在肾小 可见ＴＧＦ—Ｂ１在肾小 管上皮细胞胞浆中显 管上皮细胞胞浆中明 著表达（免疫组化Ｘ 显减少（免疫组化× ２００） ２Ｏ０） 图５ Ｂ组第１４天ＡＬＫ５， 图６ Ｃ组第１４天ＡＬＫ５， 可见ＡＬＫ５在。肾小管 与Ｂ组同时相点比 上皮细胞胞浆中显 较ＡＬＫ５在肾小管上 著表达（免疫组化× 皮细胞胞浆中表达 ２００） 明显减少（免疫组化 ×２００） 一一 图７ Ｂ组第１４天胶原Ⅲ， 图８ Ｃ组第ｌ４天胶原Ⅲ， 可见胶原Ⅲ在肾小管 与Ｂ组同时相点比较 上皮细胞胞浆中显著 胶原Ⅲ在肾小管上皮 表达，肾间质表达也 细胞胞浆及间质中中 增多（免疫组化× 表达明显减少（免疫 ２００） 组化Ｘ２００） １６７８ ３讨论 河北医药２０１０年７月第３２卷第１３期Ｈｅｂｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１０。Ｖｏｌ ３２ Ｊｕｌ Ｎｏ．１３ 及其受体ＡＬＫ５表达升高占主导地位，使胶原Ⅲ合成增加，引 起肾脏进行性损伤。在肾小管间质纤维化中期，肾脏的ＴＧＦ— Ｄ１及其受体ＡＬＫ５的表达增加更加迅速，此时，由于ＴＧＦ－３１１ 的抑制作用，最初升高的ＨＧＦ水平逐渐下调。而晚期在ＨＧＦ 表达明显下降的同时，ＴＧＦ一１３１及ＡＬＫ５进一步增加，二者的表 达呈明显负相关，且随着二者的增加，胶原Ⅲ也进一步增加。 而给予ｐＨＧＦ后，由于加入了外源性的ＨＧＦ，抑制了ＴＧＦ一３１１的 表达及生物学活性，ＡＬＫ５表达也受抑制，胶原Ⅲ合成减少，从 而改善了肾间质纤维化，具有潜在的延缓肾功能衰竭的作用。 这些结果提示，在肾间质纤维化进程中，ＨＧＦ和ＴＧＦ一１３１的作 研究表明，细胞因子在肾间质纤维化发展过程中起着重要 的作用，ＴＧＦ・１３１是一种最重要的强效的致纤维化因子，其可通 过刺激成纤维细胞合成细胞外基质成分、抑制基质金属蛋白酶 及增强基质金属蛋白酶抑制剂的活性而抑制细胞外基质降解、 刺激肾小管上皮细胞一肌成纤维细胞转分化 Ｊ、促进炎性细胞 的浸润（如单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞）及诱导细胞凋亡 参与肾间质纤维化过程。因而通过抑制ＴＧＦ一３１１的产生或阻断 其生物学活性来抑制细胞外基质沉积，成为目前治疗肾间质纤 维化的重要靶位。 ＡＬＫ丝氨酸／苏氨酸受体家族，特别是ＡＬＫ５，在ＴＧＦ一３１１ 致肾问质纤维化的过程中扮演关键角色 。ＴＧＦ一３１１的两种主 要受体分别为Ｉ型即活化素受体样激酶ＡＬＫ和Ⅱ型受体。 ＡＬＫ５活化后经过磷酸化并激活其下游的ＳＭＡＤ蛋白家族，受 体活化的Ｓｍａｄ－２、３与其共同的配体Ｓｍａｄ－４相结合，转移至细 胞核，在此通过结合Ｓｍａｄ联合的启动序列而ＴＧＦ一１３１敏感 基因的转录 ；ＡＬＫ５还可介导下游的Ｐ３８丝裂原蛋白激酶 （Ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｙｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫ）信号通路，对于ＴＧＦ．１３１ 诱导的细胞外基质合成及其他纤维化活性起重要作用。 ＨＧＦ是一种对多种器官具多效性的多肽细胞因子，在多种 动物模型中，ＨＧＦ能明显的抑制患病肾脏系膜细胞及成纤维 细胞的活化。。Ｊ，还可抑制由ＴＧＦ．３１１诱导的 一ＳＭＡ、纤维素和 Ｉ型胶原的表达 ，发挥减少细胞外基质过度生成的作用。 ＨＧＦ能够完全阻断ＴＧＦ一３１１触发整合素连接激酶（ｉｎｔｅｇｒｉｎ— ｌｉｎｋｅｄ ｋｉｎａｓｅ，ＩＬＫ）的激活及肾小管上皮细胞成纤维细胞转分 化 。ＨＧＦ还可通过多种方式抑制ＴＧＦ一３１１／Ｓｍａｄ信号传导， 从而发挥抗纤维化生物活性。在成纤维细胞内，ＨＧＦ依赖Ｅｒｋ一 １、２途径能显著的减少Ｓｍａｄ－２、３向细胞核的转移及在核内的 沉积 Ｊ，并且还可通过诱导核心蛋白聚糖（ｄｅｅｏｆｉｎ，ＤＣＮ）ｍＲＮＡ 及其蛋白的表达，阻断ＴＧＦ一３１１／Ｓｍａｄ信号传导 。此外，ＨＧＦ 还可上调Ｓｍａｄ信号传导通路抑制物ＴＧＩＦ、ＳｎｏＮ等的表达，进 一步抑制ＴＧＦ一１３１／Ｓｍａｄ信号传导。ｐＨＧＦ是从乳猪肝脏提取 的相对分子量为１０ ７００左右的活性多肽。研究发现ｐＨＧＦ具 有促进细胞增殖，稳定细胞膜，改善器官纤维化等作用，与 相对分子量为８２ ０００的肝细胞生长因子有相似的作用。目前， ｐＨＧＦ主要用于重症肝炎和早期肝硬化的临床治疗… ，未见到 有关应用ｐＨＧＦ对肾问质纤维化干预治疗的报道。 本研究应用ｐＨＧＦ对ＵＵＯ模型大鼠进行干预，观察了 ＴＧＦ．１３１、ＡＬＫ５、ＨＧＦ及胶原Ⅲ的表达情况，结果显示，ＵＵＯ组 肾小管间质区域可见ＴＧＦ．１３１、ＡＬＫ５和胶原Ⅲ的表达均呈进行 性升高，而应用ｐＨＧＦ干预后则能明显降低ＴＧＦ－３１１、ＡＬＫ５和 胶原Ⅲ的表达，且与ＵＵＯ组比较有明显差异（Ｐ＜０．０５）；ＵＵＯ 组。肾小管间质区域可见ＨＧＦ的表达早期迅速增高，后呈进行 性降低，而应用ｐＨＧＦ干预后则能明显升高ＨＧＦ的表达，且与 ＵＵＯ组比较有明显差异（Ｐ＜０．０５）。研究结果说明肾小管间 质纤维化早期的一些病理改变，诱导ＨＧＦ上升占主要地位，这 是机体产生的防御反应，以促进损伤的肾小管再生。而此后随 着病情的逐渐加重，ＨＧＦ表达量下降，而致纤维化因子ＴＧＦ一３１１ 用是相互拮抗的。内源性的ＨＧＦ可通过拮抗ＴＧＦ一１３１而发挥 抗纤维化作用，而肾ＨＧＦ水平下降会加重肾间质纤维化程度。 综合文献报道及本实验研究结果表明，ＨＧＦ与ＴＧＦ－３１１的 动态平衡在肾间质纤维化的发生、发展中起着重要的作用。外 源性ｐＨＧＦ能有效抑制肾间质中ＴＧＦ一３１１及其受体ＡＬＫ５的过 度表达，使胶原Ⅲ的合成减少，从而改善肾间质纤维化，因而对 于延缓慢性肾脏疾病向终末期肾功能衰竭发展，有一定的临床 指导意义，其具体机制有待进一步研究。 参考文献 １ Ｇｒｙｇｉｅｌｋｏ ＥＴ，Ｍａｒｔｉｎ ＷＭ，Ｔｗｅｅｄ Ｃ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ—ｂｅｔａ ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｅｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ， ２００５，３１３：９４３－９５１． ２ Ｐｈａｎｉｓｈ ＭＫ，Ｗａｈａｂ ＮＡ，Ｃｏｌｖｉｌｌｅ—Ｎａｓｈ Ｐ．Ｔｈｅ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｓｍａｄ２ ａｎｄ Ｓｍａｄ３ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｉｆｂｒｏｔｉｃ ＴＧＦ１３１ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｘｉｍａｌ—ｔｕｂｕｌｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉｌａ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，２００６，３９３：６０１－６０７． ３曹丹，张玲．Ｂ－转化生长因子与肝细胞生长因子在肾间质纤维化中 的关系．生命的化学，２００６，２６：１５２—１５４． ４ Ｍｏｒｉ Ｙ，Ｉｓｈｉｄａ Ｗ，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ Ｓ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ ５ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，２００４，５０： ４００８－４０２１． ５ Ｍａｇｄａｌｅｎａ ＩＳ．Ｔｅｒｅｓａ ＫＷ．Ｃｅｌｌ—ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ— ｂｅｔａ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｓ ｄｉｃｔａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｏａｖａｉｌ—ａｂｉｌｉｔｙ．Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉ—ｎｏｌｏｇｙ，２００６，３６：５９１－６００． ６ Ｄａｉ Ｃ．Ｌｉｕ Ｙ．Ｈｅｐａｔｃｏｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ－－１３１ ｉｎ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｓｍａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｒｅ・・ ｐｒｅｓｓｏｒ ＴＧＩＦ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００２，１３：２５８－２６２． ７ Ｇｏｎｇ Ｒ，Ｒｉｆａｉ Ａ，Ｔｏｌｂｅａ ＥＭ．Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｈａｓｅｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖｅ／ｐｌａｓｍｉｎ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｎａｌ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，２００３，１４： ３０４７．３０６０． ８ Ｌｉｕ Ｙ，Ｒａｊｕｒ Ｋ，Ｔｏｌｂｅｒｔ Ｅ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｍｅｌｉｏ－ ｒａｔｅｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｎａｌ ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ’ｍａｔｒｉｘ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２０００，６８：２０２８－２０４３． ９ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｅ，Ｓａｓａｍｕｒａ Ｈ，Ｍｉｆｕｎｅ Ｍ．Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕ— ｌａｔｅｓ ｐｒｅｔｅｏｇｌｙｃａｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｉｂｍｂｌ￣ｔｓ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２００３， ７１：１１７９—１１８８． １０ Ｍｉｚｕｎｏ Ｓ，Ｍａｔｓａｍｏｔｏ Ｋ，Ｋｕｍｓａａｗａ Ｔ．Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｃｏｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ一１３１ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｉｆｂｒｏ－ ｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２０００，６８：９３７－９４８． ‘ １１ Ｓａｔｏ Ｓ，Ｄａｉ Ｗｅｉ，Ｌｉｕ ＸＬ．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ— ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ｐ－ＨＧＦ）ａｇａｉｓｔ ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｂｒｉｄ—ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｉｖｅ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒａｔｓ，ａｎ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｙ．Ｍｅａｌ Ｅｌｅｃｔｏｒｎ Ｍｉｃｒｏｓｅ，１９９９，３２： １８４．１９２． （收稿日期：２００９—１２—２０）
