菌落总数

食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。

1 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。 1.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。

1.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 1.4 天平：感量为0.1 g。 1.5 均质器。 1.6 振荡器。

1.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

1.8 无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。 1.9 无菌培养皿：直径90 mm。

1.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 1.11 放大镜或/和菌落计数器。

2 培养基和试剂

2.1 平板计数琼脂培养基：见附录A 中A.1。 2.2 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.2。 2.3 无菌生理盐水：见附录A 中A.3。

3 检验程序

菌落总数的检验程序见图1。

检样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质

10倍稀释 选择性2个～3个适宜稀释度的样品匀液， 各取1 mL 分别加入无菌培养皿内

每皿中加入15 mL～20 mL 平板计数琼脂培养基，混匀 培养

计数各平板菌落数 计算菌落总数

报告

图1 菌落总数的检验程序

4 操作步骤

4.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 4.1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。

4.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

4.1.6 及时将 15 mL～20 mL 冷却至 46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 4.2 培养

4.2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。水产品 30 ℃±1 ℃培养 72 h±3 h。

4.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的

琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。

4.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。

4.3.1 选取菌落数在30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

4.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 4.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

5 结果与报告

5.1 菌落总数的计算方法

5.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。

5.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：

N=ΣC/(n1+0.1 n2)d„„„„„„„„„„„„„（1） 式中：

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。 示例： 稀释度 菌落数（CFU） N =ΣC/(n1+0.1 n2)d 1:100(第一稀释度) 232,244 1：1000（第二稀释度） 33，35 ==2322443335[2(0.12)]1040.0222 =24727 上述数据按7.2.2数字修约后，表示为25000或2.5×104。

5.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 5.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

5.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。

5.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

5.2 菌落总数的报告

5.2.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。 5.2.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

5.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 5.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

5.2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。

培养基和试剂

A.1 平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基 A.1.1 成分

平板计数琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.0±0.2 A.1.2 制法

将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 ℃高压灭菌15 min。 A.2 磷酸盐缓冲液

A.2.1 成分

磷酸二氢钾（KH2PO4） 34.0 g 蒸馏水 500 mL pH 7.2

A.2.2 制法

贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节

pH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。

稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。 A.3 无菌生理盐水 A.3.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL

A.3.2 制法

称取8.5ｇ氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。