miR_26a对人肝癌HepG2蛋白表达的影响

·论著·

ｍｉＲ－２６ａ对人肝癌ＨｅｐＧ２蛋白表达的影响*

刘友平１，严冬梅１，段春燕１，郭俊英２

［１．泸州医学院生物化学教研室（人类疾病细胞信号与四川省高校重点实验室），四川泸州６４６０００；２．北京空军昆明湖南路干休所，北京１００１９５］

（ｍｉＲ－２６ａ）转染对人肝癌ＨｅｐＧ２细胞表达蛋白质组的影响，以确定摘要：目的分析ｍｉｒｃｏＲＮＡ－２６ａ

经ｍｉＲ－２６ａ转染７２ｈ后裂解并ｍｉＲ－２６ａ与肝癌发生发展的相关性。方法常规培养人肝癌ＨｅｐＧ２细胞株，

提取蛋白，双向电泳分离，匹配对比各蛋白斑点的表达量，筛选主要差异表达蛋白进行质谱鉴定。结果ＨｅｐＧ２细胞经ｍｉＲ－２６ａ转染后表达蛋白谱呈现普遍下调的趋势，差异表达超过２倍及以上的蛋白斑点有１０个。其中，有３个蛋白斑点为表达上调，有７个蛋白斑点为表达下调。质谱鉴定为：膜联蛋白Ａ１、过氧化物酶４、增殖

载脂蛋白Ａ１、细胞色素Ｃ氧化酶５ａ、磷酸核糖焦磷酸激酶３、周期素依赖性蛋白激酶１和磷脂酰细胞核抗原、

乙醇胺结合蛋白。结论ｍｉＲ－２６ａ可能通过调节ＨｅｐＧ２肝癌细胞上述蛋白分子的表达，直接或间接发挥其抑

将为阐明ｍｉＲ－２６ａ的抗癌作用提供进一步的线索和癌作用。通过对这些差异表达蛋白分子机制的深入研究，

依据。

人肝癌ＨｅｐＧ２细胞株；蛋白表达关键词：ｍｉＲ－２６ａ；

中文分类号：Ｑ２９１文章标识码：Ａ

TheeffectofmiR-26aontheexpressionofproteininhuman

hepatocarcinomacellHepG2*

LIUYou-ping1,YANDong-mei1,DUANChun-yan1,GUOJun-Ying2

(1.DepartmentofBiochemistry,KeyLaboratoryofSichuanCollegesandUniversitiesforCellSignalandRegulationinHumanDiseases,LuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan6000,P.R.China;

2.BeijingSanatoriumforAirforceRetiredCadres,Kunming-HunanRoad,

Beijing100195,P.R.China)

Abstract:【Objective】TodeterminetheeffectofmicroRNA-26a(miR-26a)transfectiononproteomicexpres－sionprofileinhumanhepatocarcinomacellHepG2.【Methods】HepG2cellsweretransfectedwithmiR-26amimicsornegativecontrolfor72h.TheproteinsofHepG2cellswithorwithoutmiR-26amimictreatmentwereextractedfollowingthelysisofcellsandextractionofproteins,andtheextractedproteinwasseparatedbytwo-dimensionalelectrophoresis.Theproteomicexpressionprofileswereanalyzedbycomparativeproteomicstechniquetodiscoverimportantproteinspotswithdifferentexpressions,andtheproteinwithdifferentexpressionwithmiR-26awasiden－tifiedbyMALDI-TOF-MS.【Results】TheproteomicexpressionprofileofHepG2cellswithmiR-26amimicstreat－mentshowedageneraldown-regulation.Totaloftenproteinspotswithover2timeschangeweresuccessfullyidenti－fied,including3up-regulatedprotein(annexinA1,peroxiredoxin4andapolipoproteinA1)and6down-regulatedprotein(proliferatingcellnuclearantigen,cytochromecoxidasesubunit5A,ribose-phosphatepyrophosphokinase3,cyclin-dependentkinase1,phosphatidylethanolamine-bindingprotein1andoneunknownprotein).【Conclusion】MiR-26acouldcontributeitsanti-cancerbyregulatingtheexpressionoftheseproteinsdescribedabove.Furtherin－vestigationfortheroleoftheseproteinsonpathogenesisofhepatocellularcarcinomaisnecessary.Keywords:miR-26a;humanhepatocarcinomacellHepG2;proteinexpression

收稿日期：２０１１－１２－１０

*基金项目：四川省教育厅重点基金项目（Ｎｏ：０９ＺＡ０５０）；四川省卫生厅科技基金资助项目（Ｎｏ：２００７－４３１）

·1·

中国现代医学杂志第２２卷

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病隐匿、预后差、死亡率高，且缺乏有效的早期诊断方法和治疗靶点。寻找有效的相关肿瘤标志物用于高危人群的筛查、疾病的早期诊断、药物靶标的设计及癌变机制的研究已成为目前研究的热点。以往对肝癌的研究多集中于少数几个基因或蛋白质，随着蛋白质组学技术和方法的发展，使得分析多因素影响下的肝癌细胞表达蛋白质组的改变成为可能，从而为寻找与肝癌发生发展相关蛋白分子拓展了思路。

微小ＲＮＡ（ｍｉｒｃｏＲＮＡｓ，ｍｉＲＮＡｓ）是一类长度为２１￣２３核苷酸，进化上比较保守的非编码单链小ＲＮＡ分子，可识别特异的ｍＲＮＡ，影响靶ｍＲＮＡ的稳定性或抑制其翻译，进而调节靶基因的表达，参与细胞的增殖、分化、发育、死亡和代谢等生理过程［１－２］。目前预测人类基因组中约有１０００个ｍｉＲＮＡ，它们可能对约３０％的人类基因转录本起作用。超过５０％的ｍｉＲＮＡｓ基因位于癌症相关基因组区域或脆性位点上［３］。新近研究表明ｍｉＲＮＡｓ异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关，不同类型的肿瘤具有特异的ｍｉＲＮＡｓ异常表达谱［４－５］，它们与肿瘤的发生、病理分级、临床分期、耐药性及预后等密切相关。ｍｉＲ－２６ａ在多种组织中广泛表达，但对于其生物学功能还知之甚少［６］。目前多项研究证实，ｍｉＲ－２６ａ在多种恶性肿瘤中表达失调［７－８］，并可能参与了肿瘤的发生和发展过程。已有研究指出，ｍｉＲ－２６ａ在正常肝脏中呈高丰度表达，但在肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中表达却显著下调［９］，其分子机制不详。本实验以人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２为研究对象，采用比较蛋白组学的研究技术并结合质谱（ＭＳ）鉴定技术，筛选和鉴定经ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ转染后肝癌细胞株ＨｅｐＧ２的差异表达蛋白质，以便为进一步研究ｍｉＲ－２６ａ参与肝癌发生发展的分子机制提供线索。

过硫酸铵（ＡＰＳ）、十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）、固相ｐＨ梯度干胶条（ｐＨ３￣１０，１７ｃｍ）和矿物油购自Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司；蛋白分子量ｍａｒｋｅｒ和苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）购自碧云天生物技术研究所；其他常规试剂均购自ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ公司。低温台式离心机（ＴＤＺ４．ＷＳ）购自长沙湘仪离心机仪器有限公司；双向电泳系统、ＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ蛋白凝胶成像系统购自Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司；高速冷冻离心机购自Ｓｉｇｍａ公司。１．３细胞培养及转染

ＨｅｐＧ２肝癌细胞用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基，在３７℃，５％二氧化碳条件下培养。传代培养至细胞对数生长期，随机将细胞分为对照组和实验组两组。采用脂质体转染法将ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ和对照ｍｉｍｉｃｓ分别转入实验组和对照组ＨｅｐＧ２细胞后继续培养７２ｈ。

１．４细胞蛋白提取及蛋白定量

对照组和实验组ＨｅｐＧ２细胞用０．２５％的胰酶消化并离心。ＰＢＳ液重悬细胞并转移至ＥＰ管内（每组各收集１管），离心１２０００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ。各ＥＰ管加细胞裂解液（８ｍｏｌ／Ｌｕｒｅａ，４％ＣＨＡＰＳ，５μＬ／ｍＬＢｉｏｌｙｔｅ３￣１０，１‰ＴＢＰ）３００μＬ，冰浴３０ｍｉｎ（其间间３次）后离心１５０００ｒ／ｍｉｎ，３０ｍｉｎ。上清液断振荡２、

采用Ｂｒａｎｄｆｏｒｄ法测定蛋白浓度。１．５蛋白质组双向电泳分离

各组蛋白样品１５０μｇ加水化液（８ｍｏｌ／Ｌｕｒｅａ，４％ＣＨＡＰＳ，ＤＴＴ０．０１ｇ／ｍＬ，Ｂｉｏ－ｌｙｔｅ３￣１０５μＬ／ｍＬ，０．１％溴酚蓝痕量）至总量３５０μＬ／胶条，混匀后加入水化槽，放上ｐＨ３～１０的ＩＰＧ胶条，１ｈ后加入矿物油覆盖胶条过夜。将水化后的胶条转移至等电聚焦（ＩＥＦ）电泳系统（Ｂｉｏ－Ｒａｄ），于１７℃进行聚焦，程序设置为２５０Ｖ，２ｈ→５００Ｖ，１ｈ→１０００Ｖ，１ｈ→５０００Ｖ，２ｈ→１００００Ｖ，总伏时数６万Ｖ时结束ＩＥＦ电泳。平衡两次后采用浓度为１０％的ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶按照Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司说明书进行第二向电泳分离。最后采用银染法进行染色获得２－ＤＥ图谱。重复双向电泳３次。

１．６凝胶成像及双向电泳图谱分析

将染色后的凝胶置ＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ凝胶成像系统中照相成像。采用ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２ＤＰｌａｔｉｎｕｍｖ５．０（Ａｍｅｒｓｈａｍ）双向电泳图谱分析软件进行斑点自动识别、半定量检测及配对分析。获得各蛋白斑点的实验ｐＩ和ＭＷ，筛选标准化总灰度值（％Ｖｏｌ）相差２倍及以上的蛋白斑点，采用基质辅助激光解析电离－

１材料与方法

１．１实验对象

人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２，购自中国科学院上海生命科学研究院。

１．２主要试剂和仪器

ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ购自上海吉玛制药技术有限公司；培养基ＤＭＥＭ购自Ｓｉｇｍａ公司，丙烯酰胺（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、甲叉双丙烯酰胺（Ｎ，Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｅｕｅ－ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、超纯尿素、二硫苏糖醇（ＤＴＴ）、ＣＨＡＰＳ、甘氨酸、ＴＥＭＥＤ、ＴＢＰ、

·2·

第１９期刘友平，等：ｍｉＲ－２６ａ对人肝癌ＨｅｐＧ２蛋白表达的影响

飞行时间质谱仪（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）进行质谱检测。

质谱检测和蛋白斑点的匹配鉴定由中科院上海生科院蛋白质组研究分析中心完成。

实验组与对照组比较，蛋白质表达谱有普遍下调的趋势。经ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２ＤＰｌａｔｉｎｕｍｖ５．０软件分析，对照组共有可稳定重复的蛋白斑点１３４５个，实验组共有可稳定重复的蛋白斑点１２２０个，对照组与实验组自动匹配配对８８３对，匹配率约７２％。实

２结果

２．１ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ转染后细胞的生长状态人ＨｅｐＧ２肝癌细胞在未处理之前生长状态相

当，且均处于对数生长期。实验组和对照组细胞分别经ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ和对照ｍｉｍｉｃｓ处理７２ｈ后，于倒置显微镜下观察，细胞生长状态差别明显。实验组细胞生长状态差，细胞稀疏，培养基表面漂浮有死亡细胞；而对照组细胞生长状态良好，细胞密度大，未见死亡细胞。

２．２双向电泳及蛋白斑点匹配分析

ＨｅｐＧ２肝癌细胞表达蛋白质组经双向电泳分离和银染后获得的２－ＤＥ图谱见图１。各蛋白斑点分离较好，大多数分布在ｐＩ４￣８，分子量２０￣８５ｋＤ的范围内。同样本胶的蛋白质点在对应位置上有较好的重复性，不同胶间蛋白质点在ＰＩ和分子量方向上有一定偏差，但不影响结果的分析。

ＭＷ／Ｋｄ

１００

８５７０５０４５４０２５２０ｐｌ３

１０

ＡＢＣＤＡ，Ｂ：对照ｍｉｍｉｃｓ转染７２ｈ；Ｃ，Ｄ：ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ转染７２ｈ

图２ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ转染ＨｅｐＧ２细胞

的主要差异表达蛋白斑点

０．１８０．１６０．１４０．１２０．１００．０８０．０６０．０４０．０２０．００标准化总灰度值（％Ｖｏｌ）对照组

ｍｉＲ－２６ａ转染组

（对照ｍｉｍｉｃｓ转染７２ｈ图谱）

１２３４

５６

蛋白点

７８９１０

图１ＨｅｐＧ２人肝癌细胞株表达蛋白质组双向电泳图谱

附表

编号１２３４５６７８９１０

蛋白名称膜联蛋白Ａ１（ＡＮＸＡ１）过氧化物酶４（ＰＲＤＸ４）增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）载脂蛋白Ａ１（ＡＰＯＡ１）细胞色素Ｃ氧化酶５ａ（ＣＯＸ５Ａ）

未获鉴定结果

磷酸核糖焦磷酸激酶３（ＰＲＰＳ１Ｌ１）周期素依赖蛋白激酶１（ＣＤＫ１）磷脂酰乙醇胺结合蛋白（ＰＥＢＰ１）磷脂酰乙醇胺结合蛋白（ＰＥＢＰ１）

Ｐ２１１０８Ｐ０６４９３Ｐ３００８６Ｐ３００８６

３４，７０８３４，０９５２０，９２５２０，９２５

５．９３８．３８７．４３７．４３

图３各差异蛋白点的蛋白表达量比较

ｍｉＲ－２６ａ转染人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２差异表达蛋白斑点的鉴定结果

Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｔ理论分子理论等电实验分子实验等电

注册号量（Ｄａ）点（ｐＩ）量（Ｄａ）点（ｐＩ）Ｐ０４０８３Ｑ１３１６２Ｐ１２００４Ｐ０２６４７Ｐ２０６７４

３８，５３８３０，５４０２８，７６９３０，７７８１２，５０１

６．６４５．８６４．５７５．２７４．８８

３０，４１７２０，０４０２７，７８０１４，５３２１３，１１２２６，１５５３１，４８９２９，２７１１９，１０６１８，５５３

６．８９５．６４４．７０５．４１５．００７．６０７．５２７．８６８．０７８．１６

核苷酸代谢细胞周期细胞增殖和分化细胞增殖和分化

功能

抗凋亡、膜受体信号转导及炎症反应细胞氧化还原平衡及ＮＦκＢ信号

ＤＮＡ复制、细胞增殖

胆固醇转运、Ｃｄｃ４蛋白及Ｇ蛋白偶联受体信号转导

能量代谢

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中国现代医学杂志第２２卷

验组相对正常对照组的蛋白质表达谱在三次双向电泳图谱中均出现标准化总灰度值（％Ｖｏｌ）相差达２倍以上的蛋白点视为差异表达蛋白点，共有１０个蛋白点，见图２所示的蛋白点１￣１０。将各差异蛋白的表达量进行柱状分析，见图３，实验组蛋白点１、２和４的表达明显上调，而蛋白点３、５、６、７、８、９和１０的表达则明显下调。

２．３蛋白斑点的质谱鉴定

采用ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分别对图２中１０个差异表达的蛋白斑点进行肽指纹图谱分析。在Ｍａｓｃｏｔ搜索引擎（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）上进行数据解析，使用的数据库为ＮＣＢＩｎｒ蛋白质数据库，搜索物种（ｓｐｅｃｉｅｓｓｅａｒｃｈ）为人，共鉴定出８种蛋白。其中，斑点９和１０为同一种蛋白，斑点６未获鉴定结果，具体相关信息见附表。

使膜联蛋白Ａ１过号途径实现的。若通过基因转染，

度表达，可以减弱细胞的生长和克隆形成能力，并且增加细胞凋亡［１２］。本实验发现肝癌细胞ＨｅｐＧ２经ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ转染后表达量出现明显上调（见图２Ｂ、Ｄ蛋白点１）。可见，膜联蛋白Ａ１可能参与了ｍｉＲ－２６ａ抵抗肝癌细胞ＨｅｐＧ２的增殖和诱导ＨｅｐＧ２发生凋亡的作用。

增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）是ＤＮＡ复制所必需的一种聚合酶的附属蛋白，对细胞由Ｇ１期向Ｓ期过渡起调节作用，其含量的变化与细胞增殖的进程同一步，可作为衡量细胞增殖状态的客观指标之一［１３］。般认为，肿瘤分化程度越低，其增殖能力越强，ＰＣＮＡ

表达也越高。本实验发现，肝癌细胞ＨｅｐＧ２经ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ转染后ＰＣＮＡ的表达量出现明显下调（见图２Ａ、Ｃ蛋白点３），说明ｍｉＲ－２６ａ可通过ＰＣＮＡ的表达而参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和周期。除此之外，经ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ转染后ＣＤＫ１和磷脂酰乙醇胺结合蛋白的表达量也出现明显下调（见图２Ｂ、Ｄ蛋白点８、９），相关报道证实它们也与细胞周期相关［１４－１５］。

ｍｉｃｒｏＲＮＡ是当前研究热点之一，本实验通过表达蛋白质组学技术发现肝癌细胞ＨｅｐＧ２经ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ转染后出现显著差异表达的蛋白

分化、凋亡调节及细胞代谢等质参与了细胞的增殖、

生理活动，见表１。表达上调的蛋白，如膜联蛋白Ａ１

主要起促进细胞凋亡的作用。而表达下调的蛋白，如ＰＣＮＡ、ＣＤＫ１和ＰＥＢＰ１主要参与细胞周期的。肿瘤的发生发展与细胞增殖和凋亡的失调密切相关。因此，ｍｉＲ－２６ａ可能通过这些蛋白的表达，抑制肝癌的发生发展，促进肝癌细胞的凋亡。本文的研究结果对肝癌发生发展的基础研究有重要意义，可为其他从事肝癌研究的人员提供有益的思路。

参

考

文

献：

３讨论

根据差异表达的ｍｉＲＮＡｓ来区分肝癌组织与正常组织的精确度远远高于差异表达的编码基因。由此可见，把关键ｍｉＲＮＡ作为肝癌生物诊治的靶分子可能会比把编码基因作为靶分子更加有效［１０－１１］。

国内外研究发现，肝癌中存在ｍｉＲＮＡｓ的异常表达，因而推测ｍｉＲＮＡｓ参与了肝细胞癌变的病理过程［４］。本实验通过双向电泳和质谱技术对ＨｅｐＧ２肝癌细胞中ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ转染后表达蛋白组的变化进行了分析，发现ＨｅｐＧ２细胞经ｍｉＲ－２６ａｍｉｍｉｃｓ转染后的蛋白质表达谱出现普遍下调的趋势。通过对标准化总灰度值（％Ｖｏｌ）相差达２倍以上的差异表达蛋白斑点进行质谱鉴定，发现这些蛋白质为：膜联蛋白Ａ１、过氧化物酶４、增殖细胞核抗原、载脂蛋白Ａ１、细胞色素Ｃ氧化酶５ａ、磷酸核糖焦磷酸激酶３、周期素依赖蛋白激酶１、磷脂酰乙醇胺结合蛋白和周期素Ｅ２。其中，膜联蛋白Ａ１、过氧化物酶４和载脂蛋白Ａ１（蛋白斑点１、２、４）的表达明显上调，而增殖细胞核抗原、细胞色素Ｃ氧化酶５ａ、磷酸核糖焦磷酸激酶３、周期素依赖蛋白激酶１、磷脂酰乙醇胺结合蛋白和周期素Ｅ２（蛋白斑点３、５、７、８、９、１０、１１）的表达则明显下调，见图２。

膜联蛋白Ａ１是钙和磷脂结合蛋白，在很多方面发挥重要生物学功能，参与细胞增殖和死亡信号的调节、凋亡细胞的吞噬以及肿瘤的发生与发展，具有抗细胞增殖和诱导凋亡的作用。已有研究表明，膜联蛋白Ａ１的抗增殖作用是通过激活ＭＡＰＫ／ＥＲＫ信

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