ＴＴＥＲ ＶＯ１．・ 斗ｌ２４ Ｎ。． ｏ・４ Ｊ珥 ｔｕｔ・．・，２０， …１．５ ＬＥ，ＩＴＩ’ Ｓ ＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ…生技术通讯４６７ ｄｏｉ：１０．３９６９６．ｉｓｓｎ．１００９－０００２．２０１３．０４．００４ 研究报告 慢病毒介导的ｍＴＯＲ敲低肝癌细胞株ＨｅｐＧ２的构建及初 步功能检测 刘家宏 ，徐小洁 ，符静 ，范忠义 ，吕朝晖 ，陆菊明 ，肖文华ｈ，朱建华ｈ，叶棋浓 １．军事医学科学院生物工程研究所，北京１００８５０； ２．总医院ａ．第一附属医院肿瘤一科，北京１０００３７；ｂ．内分泌科，北京１００８５３ ［摘要］ 目的：建立高效稳定的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ｍＴＯＲ）小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）细胞导入方法，并对ｍＴＯＲ敲 低的ＨｅｐＧ２肝癌细胞株的功能进行初步检测。方法：构建了２条不同的人ｒｏＴＯＲ慢病毒ｓｉＲＮＡ载体ｐＬｅｎｔｉ—Ｈ１／ ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ，与３个包装质粒共转染２９３Ｔ细胞，包装成慢病毒后感染ＨｅｐＧ２细胞；经嘌呤霉素筛选２周后，收集细 胞进行Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹，检测ｍＴＯＲ敲减效果及其下游基因ｃ—ｍｙｃ、周期蛋白Ｄ１（ｃｙｃｌｉｎＤ１）表达水平及４Ｅ—ＢＰ１、Ｓ６Ｋ１磷 酸化水平的变化。结果：ＲＴ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果显示，构建的ｐＬｅｎｔｉ—ＨＩ／ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ能有效抑制ｍ册 基因 的表达，敲低了ｍＴＯＲ蛋白水平，且沉默ｍＴＯＲ后其下游基因ｃ．＿ｍｙｃ、ＣｙｃｌｉｎＤ１的表达水平及４Ｅ—ＢＰ１、Ｓ６Ｋ１磷酸化水 平降低。结论：构建了慢病毒介导ＲＮＡ干扰ｍＴＯＲ表达载体，为进一步研究ｍＴＯＲ通路奠定了实验基础。 ［关键词］ 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；ＲＮＡ干扰；慢病毒 ［中图分类号］Ｑ７８ 【文献标识码］Ａ 【文章编号］ １００９—０００２（２０１３）Ｏ４—０４６７—０４ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｏｆ ａ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－Ｍｅｄｉ－ ａｔｅｄ ｍＴＯＲ Ｋｎｏｃｋ－Ｄｏｗｎ Ｈｅｐａｔｏｍａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＨｅｐＧ２ Ｌ／Ｕ Ｊｉａ－Ｈｏｎｇ ’ ，ＸＵ Ｘｉａｏ－Ｊｉｅ ，ＦＵ Ｊｉｎｇ ，ＦＡＮ Ｚｈｏｎｇ—Ｙｉ ，ＬＯ Ｃｈａｏ—Ｈｕｉ ， ＬＵ 一 ，ＸＩＡＯ Ｗｅｎ－Ｈｕａ ａ，ＺＨＵ Ｊｉａｎ－Ｈｕａ ，ＹＥ Ｑｉ－Ｎｏｎｇ １．Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８５０；２．ａ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉ－ ｊｉｎｇ １０００３７；ｂ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００３７；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＰＬＡ，Ｃｈｉｎａ Ｃｏ－ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒｓ，ＹＥ Ｑｉ－Ｎｏｎｇ，Ｅ－ｍａｒｌ：ｙｅｑｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ；ＺＨＵ Ｊｉａｎ－Ｈｕａ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｊｈｕａ１６８＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎ ｅｉｃｉｆｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ） ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＨｅｐＧ２ ａｎｄ ａｓｓａｙ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ．Ｍｅｔｈ－ ｏｄｓ：Ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＬｅｎｔｉ—Ｈ １／ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｌｅｎｔｉｖｉｕｓ ｐａｒｔｉｒｃｌｅｓ．Ａｆｔｅｒ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈａｒｖｅｓｔ— ｅｄ ｖｉｕｓｅｓｒ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ２ ｗｅｅｋｓ ｗｉｔｈ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍＴＯＲ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ ＲＴ—ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎｄ ｑＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐＬｅｎｔｉ－Ｈｌ／ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ ｃｏｕｌｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｒｏＴＯＲ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍＴＯＲ ｃｏｕｌｄ ｍａｒｋ— ｅｄｌｙ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｔｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｔａｒｇｅｔｓ ｓｕｃｈ ａｓ ４Ｅ—ＢＰ１ ａｎｄ Ｓ６Ｋ１，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｃ－ｍｙｃ ａｎｄ ｃｙｃｌｉｎＤ１ ｇｅｎｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ｌｅｎｔｉｖｉｕｓ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ ｗｅｒｅ ｏｂｔｒａｉｎｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｌａｙｓ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ；ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ｌｅｎｔｉｖｉｕｓｒ １９９１年在酵母菌中发现雷帕霉素靶蛋白（ｔａｒ． ｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ，ＴＯＲ）的基因，后来人们在哺乳动 物细胞中发现了与其结构相应的哺乳动物ＴＯＲ （ｍａｍｍａｌｉａｎ ＴＯＲ，ｍＴＯＲ），有ｍＴＯＲＣ１和ｍＴＯＲＣ２ 收稿日期：２０１２—１２—１７ 等２种复合体形式。其中，ｍＴＯＲＣ１经ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／ ＡＫＴ信号通路激活后，参与调节蛋白质合成代谢、转 录和细胞自噬过程” ；ｍＴＯＲＣ２主要调节细胞骨架组 装。作为一种丝一苏氨酸蛋白激酶，ｍＴＯＲ在ＰＩ３Ｋ／ ＡＫＴ信号通路中发挥重要作用，并逐渐成为肿瘤治 疗的新靶点口 】。ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ， 基金项目：国家自然科学基金（３０８７２９３９，３１１００６０４） 作者简介：刘家宏（１９８６一），女，硕士研究生；徐小洁（１９８２一），女， ＲＮＡｉ）是近年发展起来的特异性强、效率高的新型 基因阻断技术 。本实验室先前利用ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ—Ｕ６ 作为载体沉默相应靶基因，但该载体存在一定的缺 助理研究员；符静（１９８６一），女，博士研究生；三者均为第一作者 通信作者：叶棋浓，（Ｅ—ｍａｉｌ）ｙｅｑｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ；朱建华，（Ｅ—ｍａｉｌ） ｚｊｈｕａ１６８＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ ＬＥＴＴＥＲ Ｖ 二斗ｌ ｏ・。．４ 斗 ＪＵ ＺＵＩ １．ｌ－，２０１３， ＴＴ ＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｏ１．技 术 通 讯ｖ・２４Ｎ点，如基因沉默维持时间短、体内运载难和转染效率 低等。在本实验中，我们拟采用慢病毒作为载体沉 ０－４ Ｉｘｇ ｐｌｐ２和０．５６ Ｉｘｇ Ｖｓｖｇ等３种包装质粒在不含 血清双抗的ＤＭＥＭ中混合均匀，然后再分别与９ 默ｍＴＯＲ基因，该载体的最大特点是感染效率高，可 Ｌ脂质体Ｍｅｇａｔｒａｎ混匀，室温放置１０ ｍｉｎ，转染 ４８或７２ ｈ后收集细胞培养上清，３０００ ｒ／ 在宿主体内长期表达，且不易诱发宿主免疫反应， ２９３Ｔ细胞，安全性好 】。我们以肝癌ＨｅｐＧ２细胞系作为模型， ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清，弃去细胞碎片，按每孔 将ｍＴＯＲ基因小干扰ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ， ３００ Ｌ病毒原液缓慢滴加到提前准备好的ＨｅｐＧ２ ｓｉＲＮＡ）包装成慢病毒，感染ＨｅｐＧ２细胞，通过检测 ＨｅｐＧ２中ｍＴＯＲ表达水平及其下游靶基因的改变， 以确定ｍＴＯＲ是否被敲低，为后续研究ｍＴＯＲ信号 细胞中，２４ ｈ后弃掉病毒液，更换为含５％、胎牛血清 （ＦＢＳ）的新鲜培养液。 １．４ ｑＲＴ—ＰＣＲ检ｉ受ｑ ｐＬｅｎｔｉ—Ｈ１／ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ对 通路奠定实验基础。 １材料与方法 １．１ 材料 人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２、人胚肾２９３Ｔ细胞及大肠 杆菌ＤＨ５ａ由本室保存；ｐＬｅｎｔｉ—Ｈ１载体购自Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司；抗ｍＴＯＲ、抗ｐ－ｍＴＯＲ、抗ｐ－￥６Ｋ１、 抗Ｓ６Ｋ１、抗Ｐ一４ＥＢＰ１、抗４ＥＢＰ１的兔多克隆抗体购 自Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ公司；抗ｃ—ｍｙｃ的鼠多克隆抗体、抗周 期蛋白Ｄ（ｃｙｃｌｉｎＤ）兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶 偶联的羊抗兔ＩｇＧ均购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司；各种分子 生物学试剂分别购自ＴａＫａＲａ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｐｉｅｒｃｅ及Ｉｎｖｉｔ— ｒｏｇｅｎ公司；引物由北京赛百盛基因技术有限公司合 成；测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。 １．２ ｒｏＴＯＲ ｓｉＲＮＡ慢病毒重组质粒构建与鉴定 根据文献合成２对ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ序列。ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ １上游序列为５＂－ＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＴＣＡＡＡＧＡＧＣ ＡＧＡＧＴＧＣＣＴＹＣＣＴＧＴＣＡＧＡＧＣＡＣＴＣＴＧＣＴＣ Ｉ ＧＡＴ ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧ一３ ，下游序列为５ 一ＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣ ＴｒＡＧｒＩｖＩＴＣＴＣＧＴＣＴＣＡＣＧＡＧＡＣＴＧＴＣＣＴｒＣＣＧＴＧＡＧ ＡＣＧＡＧＡＡＡＣＴＡＡＧＡＡＣ一３ ；ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ２上游序列 为５ 一ＧＡＴＣＣＣＡＧＧＣＣＴＡＴＧＧＴＣＧＡＧＡｍ’ＡＣＴＴＣＣＴ ＧＴＣＡＧＡＴＡＡＡＴＣＴＣＧＡＣＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＴＩ’ＴＴＴＧ一３ ． 下游序列为５＂－ＴＩ＇ＡＡＧ ［ⅥＴＧＴＣＣＧＧＡＴＡＣＣＡＧＣＴＣＴ ＡＡＡＴＡＧＡＣＴＧＴＣＣＴＴＣＡ１ＴＩＴＡＧＡＧＣＴＧＧＴＡＴＣＣＧＣＡ ＣＣ一３ 。将合成的寡核苷酸片段的正义链和反义链进 行退火处理。即先将其分别溶于双蒸水中，等摩尔数 混合后９Ｏ℃加热３ ｍｉｎ，自然降温至３７ｑｃ后形成双链 的寡核苷酸。将合成的发卡ｓｉＲＮＡ插入经ＢａｍＨ Ｉ和 ＥｃｏＲ Ｉ双酶切的ｓｉＲＮＡ表达载体ｐＬｅｎｔｉ—Ｈ１中，构建 成ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ慢病毒重组质粒。挑取阳性克隆进行 测序鉴定。 １．３ ｐＬｅｎｔｉ—Ｈ１／ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ慢病毒的包装和感染 为检测慢病毒感染效率，将２９３Ｔ细胞接种于６ 孑Ｌ板，次１３待细胞密度达８０％左右时，分别将１ ｇ 的２种慢病毒重组质粒ｐＬｅｎｔｉ—Ｈ１一ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ和 对照病毒ｐＬｅｎｔｉ—ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ与０．８４ Ｉｘｇ ｐｌｐｌ、 ｍ ０Ｒ转录水平的抑制效果 收集感染病毒的细胞，用ｌｘＰＢＳ洗１次，每支ＥＰ 管中加入１ ｍＬ ＴＲＩｚｏｌ，室温放置５ ｍｉｎ，加入０．２ ｍＬ氯仿，剧烈振荡１５ Ｓ，室温放置３ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，取上清，加入等体积异丙醇，室温 放置１０ ｍｉｎ，４℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，弃上 清，用１ ｍＬ ７５％乙醇洗１次，高速离心１０ ｍｉｎ，再 用１ ｍＬ无水乙醇洗１次，高速离心后去上清，自然 干燥ＲＮＡ约３０ ｍｉｎ，加入２０ Ｌ ＤＥＰＣ水溶解沉 淀，即为提取的总ＲＮＡ。取总ＲＮＡ ２ Ｉｘｇ，与１ ＩｘＬ ５０ Ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ的随机引物混匀，７０℃解链５ ｍｉｎ，自然冷 却至室温，加入反转录酶、ｄＮＴＰ、ＲＮＡ酶抑制剂及反 转录缓冲液，补水至终体积为２５“Ｌ，４２℃反应１ ｈ， ９５℃灭活５ ｍｉｎ，得到反转录的ｃＤＮＡ第一链。将得 到的ｃＤＮＡ按１：２０稀释，取９．２ Ｌ模板与１Ｏ Ｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ（２ｘ）、上下游引物各０．４ Ｌ混匀， 进行ｑＲＴ—ＰＣＲ，对所得数据按２－ａａｃｔ公式计算出基因 表达的相对量，然后进行相应的统计学分析。 １．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测ｐＬｅｎｔｉ—Ｈ ｌ／ｍＴ０Ｒ ｓｉＲＮＡ对 ｍＴＯＲ的干扰效果及对下游基因的影响 用２种ｐＬｅｎｔｉ—Ｈ１／ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ和对照组病毒 Ｌｅｎｔｉ—ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ分别感染ＨｅｐＧ２细胞，３ ｄ后加 入嘌呤霉素（２￣ｇ／ｍＬ）筛选２周左右，收集细胞，检 测病毒感染后ＨｅｐＧ２细胞中ｍＴＯＲ蛋白的表达水平 及其下游基因４ＥＢＰ１、Ｓ６Ｋ 、ｃ—ｍｙｃ、ｃｙｃｌｉｎＤ１的蛋白 水平变化。 ２ 结果 ２．１ ｍ 尺发卡ｓｉＲＮＡ模板的设计及表达载体的构 建 根据文献报道的ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡ序列合成了２对 ｍＴＯＲ发卡ｓｉＲＮＡ。发卡ｓｉＲＮＡ包含作为ｓｉＲＮＡ靶 点的１９个碱基及其互补序列，靶序列与互补序列之 间由９个碱基组成的环隔开，两端分别是含ＢａｍＨ Ｉ 和ＥｃｏＲ Ｉ酶切位点的粘性末端。将２对ｓｉＲＮＡ退火 后连入经ＢａｍＨ Ｉ和ＥｃｏＲ Ｉ双酶切的ｓｉＲＮＡ表达载 体ｐＬｅｎｔｉ—Ｈ１中，构建成ｓｉＲＮＡ重组质粒。测序结果 ４７０ 生ＬＴＴＥ ＮＢ［ＯＴｙ ・，．２４ Ｎ 辞 ｏ・ｏ．４ Ｊ珥 ｔｕｌ ．・，２ｏ１３ ’ ｕＩｊ Ｅ１１ ＲＳ ＩＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ｖｏｌｐ Ｈ 技术通讯降解，而且对基因沉默的持续时间短，这些缺点都不 Ｐ Ｂ Ｊｒ．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ［６】Ｓｉｎｎ Ｐ Ｌ，Ｓａｕｔｅｒ Ｓ Ｌ，ＭｃＣｒａｙ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ａｎｄ ｒｅｔｒｏｖｉ－ ｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ－－ｄｅｓｉｇｎ，ｂｉｏｓａｆｅｔｙ， ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， 能满足应用于临床治疗的需求 。以慢病毒作为 载体的最大特点，是在感染期细胞的同时还可 ２００５，１２（１４）：１０８９一ｌ０９８． 以感染非期细胞，并可在宿主体内长期表达，且 不易诱发宿主免疫反应，安全性好 。 【７】Ｚｈｏｕ Ｘ，Ｔａｎ Ｍ，Ｓｔｏｎｅ Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｋｔ／ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ／４Ｅ－ＢＰ１ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ＥｒｂＢ２ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎ— 综上所述，我们构建了人ｍＴＯＲ慢病毒ｓｉＲＮＡ 载体，并验证了慢病毒介导的ＲＮＡｉ能有效抑制 ｏＴＯＲ的表达。当ｍＴＯＲ蛋白被敲低后，肝癌ＨｅｐＧ２ ｒ细胞的ｍＴＯＲ下游基因产物４Ｅ—ＢＰ１和Ｓ６Ｋ１的磷酸 ｃｅｒｓ［Ｊ１．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００４，１０（２０）：６７７９－６７８８． 【８】Ｓｍｉｔｈ Ｐ Ｇ，Ｗａｎｇ Ｆ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ Ｋ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓ— ｔｅｒａｓｅ ＰＤＥ４Ｂ ｌｉｍｉｔｓ ｃＡＭＰ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５ 化水平显著降低。另外，我们通过嘌呤霉素筛选获 得了ｍＴＯＲ稳定敲低的ＨｅｐＧ２细胞株，为进一步研 究ｍＴＯＲ信号通路在肝癌发生、发展中的作用奠定 了坚实的实验基础与细胞模型。 参考文献 Ｈｏｌｚ Ｍ Ｋ，Ｂｌｅｎｉｓ Ｊ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ １ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｍｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴ０Ｒ）一ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ 『Ｊ１．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００５，２８０（２８）：２６０８９—２６０９３． Ｆｏｓｔｅｒ Ｋ Ｇ，Ｆｉｎｇａｒ Ｄ Ｃ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ：ｃｏｎ－ ｄｕｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｓｙｍｐｈｏｎｙ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１０， ２８５（１９）：１４０７１－１４０７７． Ｐｅｎｅ Ｆ，Ｃｌａｅｓｓｅｎｓ Ｙ Ｅ，Ｍｕｌｌｅｒ ０，ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈａ． ｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３－ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ ａｎｄ ｍＴＯＲ／Ｐ７０Ｓ６一ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ［Ｊ］．Ｏｎ－ ｃｏｇｅｎｅ，２００２，２１ｆ４３）：６５８７—６５９７． Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ Ａ．Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ－－ｎｅｗ ｈｏｐｅ ｆｏｒ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ［Ｊ】？Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２００２，２（３）：１６７—１６８． 熊震，汤旭东，房殿春，等．肝素酶ＲＮＡｉ对ＨｅｐＧ２肝癌细胞生 物学行为的影响［Ｊ】．实用临床医药杂志，２００８，１２（１）：１２—１６． （１）：３０８－３１６． ［９】Ｓｌｏｍｏｖｉｔｚ Ｂ Ｍ，Ｃｏｌｅｍａｎ Ｒ Ｌ．Ｔｈｅ ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ ｐａｔｈｗａｙ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒａｇｅｔ ｉｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１２，１８（２１）：５８５６—５８６４． 【１０】Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｒ，Ｘｉａｏ Ｙ．Ｖｅｒｔｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＩ３Ｋ／ Ａｋｔ／ｍＴＯＲ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１２，１ １４（２）：２４５－２４９． ［１ １】Ｌｏｒｕｓｓｏ Ｐ Ｍ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ ａｓ ａ ｒａｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ２０１３，８４（１）：４３－５６． 【１２］Ｖａｒｔａｎｉａｎ Ｒ，Ｍａｓｒｉ Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．ＡＰ－１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｙｃｌｉｎ Ｄ １ ａｎｄ ｃ—ＭＹＣ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ＡＫＴ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｍＴＯＲ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＡＩＰ４／ｈｃｈ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ＪＵＮＢ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１１，９（１）：１１５—１３０． ［１３】Ｘｕ Ｄ Ｚ，Ｇｅｎｇ Ｑ Ｒ，Ｔｉａｎ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒ— ｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，２０１０，１０：５３６—５４６． 【１４】Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ Ｍ，Ｈａｒｂｏｒｔｈ Ｊ，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ２１－ｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅ ＲＮＡｓ ｍｅｄｉａｔｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒ［ｅｒｅｎｃｅ ｊｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１ １（６８３６）：４９４—４９８． 【１５】Ｓｃｈｅｒｒ Ｍ，Ｍｏｒｇａｎ Ｍ Ａ，Ｅｄｅｒ Ｍ．Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００３，１０（３）：２４５—２５６．
