毛囊干细胞制备方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110904033 A(43)申请公布日 2020.03.24

(21)申请号 2019110052.X(22)申请日 2019.11.08

(71)申请人 浙江卫未生物医药科技有限公司

地址 310052 浙江省杭州市滨江区长河街

道秋溢路288号2幢2层201室(72)发明人 陈锦阳　袁博　刘军权　(74)专利代理机构 天津市尚仪知识产权代理事

务所(普通合伙) 12217

代理人 王山(51)Int.Cl.

C12N 5/074(2010.01)

权利要求书1页 说明书3页 附图1页

()发明名称

毛囊干细胞制备方法

(57)摘要

本发明公开了一种毛囊干细胞制备方法，包括以下步骤：剪取志愿者头发毛囊根部，清洗后，加入0.25% Dispase酶，37℃消化0.5-1.5h；酶消化后，接种于毛囊干细胞培养基中，培养条件为37℃、5% CO2，每1-2d换液一次；毛囊干细胞的扩增：将步骤S2获得的毛囊干细胞转接到毛囊干细胞扩增培养基中继续培养；所述毛囊干细胞扩增培养基包括以下组分：DMEM基础培养基、FBS、T-β、hEGF、VEGF以及Rho相关激酶；毛囊干细胞的纯化。通过本发明方法制备的毛囊干细胞能够长期体外传代培养，并且具有很高的再生和分化能力为毛囊干细胞施用于治疗皮肤缺损奠定了基础，具有很好的临床应用前景。

CN 110904033 ACN 110904033 A

权　利　要　求　书

1/1页

1.一种毛囊干细胞制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.剪取志愿者头发毛囊根部，清洗后，加入0.25% Dispase酶，37℃消化0.5-1.5h；S2.酶消化后，接种于毛囊干细胞培养基中，培养条件为37℃、5% CO2，每1-2d换液一次；所述毛囊源培养基包括以下组分：DMEM/F12培养基、血清替代物、复合维生素、氨基酸、细胞生长因子、L-谷氨酰胺、青链霉素双抗溶液、羟基乙醇、海藻糖、倍他米松；

S3.毛囊干细胞的扩增：将步骤S2获得的毛囊干细胞转接到毛囊干细胞扩增培养基中继续培养；所述毛囊干细胞扩增培养基包括以下组分：DMEM基础培养基、FBS、T-β、hEGF、VEGF以及Rho 相关激酶；

S4. 毛囊干细胞的纯化：用IV型胶原包被毛囊干细胞，反应1.5-2.5h后用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中， 一段时间后将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出，贴壁的细胞转接于完全培养基培养。

2.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞制备方法，其特征在于：步骤S1中，获取头发毛囊根部后，将其剪成1×1cm的正方形。

3.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞制备方法，其特征在于：步骤S1中 Dispase酶的消化时间为1h。

4.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞制备方法，其特征在于：步骤S2中，毛囊源培养基包括以下组分和配比：血清替代物 2-15 v/v%；复合维生素 20-90 ug/ml；氨基酸 20-30 ng/ml；细胞生长因子 1.5-9 ng/ml；L-谷氨酰胺 3-7 mmol/ml；青链霉素双抗溶液 12-18μM；羟基乙醇 18-25μM；壳聚糖 5-10μg/ml；倍他米松 10-15 ng/ml；余量为DMEM/F12培养基。

5.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞制备方法，其特征在于：步骤S2中，毛囊源培养基包括以下组分和配比：血清替代物 8 v/v%；复合维生素 50 ug/ml；氨基酸 25 ng/ml；细胞生长因子 4 ng/ml；L-谷氨酰胺 5 mmol/ml；青链霉素双抗溶液 15μM；羟基乙醇 22μM；壳聚糖 7μg/ml；倍他米松 12 ng/ml；余量为DMEM/F12培养基。

6. 根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞制备方法，其特征在于：步骤S3中，毛囊干细胞扩增培养基包括以下组分和配比：FBS、0.005-0.008% T-β、50-150 ng/ml hEGF、50-150 ng/ml VEGF以及15-25 uM Rho相关激酶，余量为DMEM基础培养基。

7.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞制备方法，其特征在于：步骤S3中，毛囊干细胞扩增培养基包括以下组分和配比：FBS、0.006% T-β、100 ng/ml hEGF、100 ng/ml VEGF以及20 uM Rho相关激酶，余量为DMEM基础培养基。

8.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞制备方法，其特征在于：步骤S4中，胰蛋白酶反应消化时间为2h。

2

CN 110904033 A

说　明　书毛囊干细胞制备方法

1/3页

技术领域

[0001]本发明涉及生物技术领域，具体是一种毛囊干细胞制备方法。

背景技术

[0002]皮肤作为人体最大的器官，具有感觉、调节体温、分泌与排泄、防止水分蒸发等多种作用，其中最主要的功能是作为人体与外界环境的屏障以维持内环境的稳定，同时其也是免疫系统的重要组成部分。目前，各种涉及皮肤缺损的外伤特别是烧伤、压轧伤、切割伤等也越来越多。其中，外伤导致的皮肤大面积缺损常常导致非常严重的肢体残疾，甚至死亡。目前临床上治疗皮肤缺损的标准治疗方法是自体皮肤移植，由于具有无免疫排斥反应，成活率高等特点，其在临床上应用极为广泛，并取得了很好的疗效。但自体皮肤移植的缺点也非常明显，由于是自体取材，其本身就是对患者的再次损伤，极大增加了患者痛苦，而且有发生供皮区感染，不愈合等并发症的风险。更为严重的是，对于上述的大面积皮肤缺损，常由于缺乏足够可供移植的自体皮肤而导致创面修复困难，严重影响了治疗进程，甚至导致死亡。

[0003]干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。头发毛囊中含有大量干细胞，是最容易获得的干细胞来源之一。毛囊干细胞是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。体外培养研究中的毛囊干细胞表现出高克隆形成能力，具有很高的再生潜能。由于毛囊干细胞来源于毛发，可以直接从人体自身取得，数量极其丰富，且没有任何并发症，对人完全无创，现已成为皮肤组织工程学研究的焦点。发明内容

[0004]本发明就是为了解决上述技术问题，所提出一种毛囊干细胞制备方法。[0005]本发明是按照以下技术方案实现的。[0006]一种毛囊干细胞制备方法，包括以下步骤：

S1.剪取志愿者头发毛囊根部，清洗后，加入0.25% Dispase酶，37℃消化0.5-1.5h；S2.酶消化后，接种于毛囊干细胞培养基中，培养条件为37℃、5% CO2，每1-2d换液一次；所述毛囊源培养基包括以下组分：DMEM/F12培养基、血清替代物、复合维生素、氨基酸、细胞生长因子、L-谷氨酰胺、青链霉素双抗溶液、羟基乙醇、海藻糖、倍他米松；

S3.毛囊干细胞的扩增：将步骤S2获得的毛囊干细胞转接到毛囊干细胞扩增培养基中继续培养；所述毛囊干细胞扩增培养基包括以下组分：DMEM基础培养基、FBS、T-β、hEGF、VEGF以及Rho 相关激酶；

S4. 毛囊干细胞的纯化：用IV型胶原包被毛囊干细胞，反应1.5-2.5h后用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中， 一段时间后将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出，贴壁的细胞转接于完全培养基培养。[0007]进一步的，步骤S1中，获取头发毛囊根部后，将其剪成1×1cm的正方形。

3

CN 110904033 A[0008]

说　明　书

2/3页

进一步的，步骤S1中 Dispase酶的消化时间为1h。

[0009]进一步的，步骤S2中，毛囊源培养基包括以下组分和配比：血清替代物 2-15 v/v%；复合维生素 20-90 ug/ml；氨基酸 20-30 ng/ml；细胞生长因子 1.5-9 ng/ml；L-谷氨酰胺 3-7 mmol/ml；青链霉素双抗溶液 12-18μM；羟基乙醇 18-25μM；壳聚糖 5-10μg/ml；倍他米松 10-15 ng/ml；余量为DMEM/F12培养基。[0010]进一步的，步骤S2中，毛囊源培养基包括以下组分和配比：血清替代物 8 v/v%；复合维生素 50 ug/ml；氨基酸 25 ng/ml；细胞生长因子 4 ng/ml；L-谷氨酰胺 5 mmol/ml；青链霉素双抗溶液 15μM；羟基乙醇 22μM；壳聚糖 7μg/ml；倍他米松 12 ng/ml；余量为DMEM/F12培养基。[0011]进一步的，步骤S3中，毛囊干细胞扩增培养基包括以下组分和配比：FBS、0.005-0.008% T-β、50-150 ng/ml hEGF、50-150 ng/ml VEGF以及15-25 uM Rho相关激酶，余量为DMEM基础培养基。[0012]进一步的，步骤S3中，毛囊干细胞扩增培养基包括以下组分和配比：FBS、0.006% T-β、100 ng/ml hEGF、100 ng/ml VEGF以及20 uM Rho相关激酶，余量为DMEM基础培养基。[0013]进一步的，步骤S4中，步骤S4中，胰蛋白酶反应消化时间为2h。[0014]本发明获得了如下的有益效果。

[0015]本发明提供了一种新的毛囊干细胞制备方法，通过本发明方法制备的毛囊干细胞能够长期体外传代培养，并且具有很高的再生和分化能力为毛囊干细胞施用于治疗皮肤缺损奠定了基础，具有很好的临床应用前景。附图说明

[0016]图1是本发明采用实施例3方法制备的毛囊源细胞光学显微镜图。

具体实施方式

[0017]下面结合附图及实施例对本发明进行进一步说明。[0018]实施例1

一种毛囊干细胞制备方法，包括以下步骤：S1.剪取志愿者头发毛囊根部，将其剪成1×1cm的正方形清洗后，加入0.25% Dispase酶，37℃消化1h；

S2.酶消化后，接种于毛囊干细胞培养基中，培养条件为37℃、5% CO2，每1-2d换液一次；毛囊源培养基包括以下组分和配比：血清替代物 2 v/v%；复合维生素 20 ug/ml；氨基酸 20 ng/ml；细胞生长因子 1.5 ng/ml；L-谷氨酰胺 3 mmol/ml；青链霉素双抗溶液 12μM；羟基乙醇 18μM；壳聚糖 5μg/ml；倍他米松 10 ng/ml；余量为DMEM/F12培养基；

S3.毛囊干细胞的扩增：将步骤S2获得的毛囊干细胞转接到毛囊干细胞扩增培养基中继续培养；毛囊干细胞扩增培养基包括以下组分和配比：FBS、0.005% T-β、50 ng/ml hEGF、50 ng/ml VEGF以及15 uM Rho相关激酶，余量为DMEM基础培养基；待细胞密度为80-90%收集；

S4. 毛囊干细胞的纯化：用IV型胶原包被毛囊干细胞，反应2h后用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，一段时间后将未贴壁的细胞连同培养液一

4

CN 110904033 A

说　明　书

3/3页

起吸出，贴壁的细胞转接于完全培养基培养。[0019]实施例2

一种毛囊干细胞制备方法，包括以下步骤：S1.剪取志愿者头发毛囊根部，将其剪成1×1cm的正方形清洗后，加入0.25% Dispase酶，37℃消化1h；

S2.酶消化后，接种于毛囊干细胞培养基中，培养条件为37℃、5% CO2，每1-2d换液一次；毛囊源培养基包括以下组分和配比：血清替代物 15 v/v%；复合维生素 90 ug/ml；氨基酸 30 ng/ml；细胞生长因子 9 ng/ml；L-谷氨酰胺 7 mmol/ml；青链霉素双抗溶液 18μM；羟基乙醇 25μM；壳聚糖 10μg/ml；倍他米松 15 ng/ml；余量为DMEM/F12培养基；

S3.毛囊干细胞的扩增：将步骤S2获得的毛囊干细胞转接到毛囊干细胞扩增培养基中继续培养；毛囊干细胞扩增培养基包括以下组分和配比：FBS、0.008% T-β、150 ng/ml hEGF、150 ng/ml VEGF以及25 uM Rho相关激酶，余量为DMEM基础培养基；待细胞密度为80-90%收集；

S4. 毛囊干细胞的纯化：用IV型胶原包被毛囊干细胞，反应2h后用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，一段时间后将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出，贴壁的细胞转接于完全培养基培养。[0020]实施例3

一种毛囊干细胞制备方法，包括以下步骤：S1.剪取志愿者头发毛囊根部，将其剪成1×1cm的正方形清洗后，加入0.25% Dispase酶，37℃消化1h；

S2.酶消化后，接种于毛囊干细胞培养基中，培养条件为37℃、5% CO2，每1-2d换液一次；毛囊源培养基包括以下组分和配比：血清替代物 8 v/v%；复合维生素 50 ug/ml；氨基酸 25 ng/ml；细胞生长因子 4 ng/ml；L-谷氨酰胺 5 mmol/ml；青链霉素双抗溶液 15μM；羟基乙醇 22μM；壳聚糖 7μg/ml；倍他米松 12 ng/ml；余量为DMEM/F12培养基；

S3.毛囊干细胞的扩增：将步骤S2获得的毛囊干细胞转接到毛囊干细胞扩增培养基中继续培养；毛囊干细胞扩增培养基包括以下组分和配比：FBS、0.006% T-β、100 ng/ml hEGF、100 ng/ml VEGF以及20 uM Rho相关激酶，余量为DMEM基础培养基；待细胞密度为80-90%收集；

S4. 毛囊干细胞的纯化：用IV型胶原包被毛囊干细胞，反应2h后用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，吹打成单细胞悬液接种于培养皿中，一段时间后将未贴壁的细胞连同培养液一起吸出，贴壁的细胞转接于完全培养基培养。

[0021]采用本发明实施例3方法制备的毛囊干细胞的电镜图参见图1。

[0022]最后应说明的是以上各实施例仅用以说明本发明的实施例的技术方案，而非对其；尽管参照前述各实施例对本发明的实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术 人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分 或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离 本发明的实施例各实施例技术方案的范围。

5

CN 110904033 A

说　明　书　附　图

1/1页

图1

6