微囊藻及其毒素的分子生物学研究进展

自蓝井手连展　第１２卷第４期２００２年４月　微囊藻及其毒素的分子生物学研究进展　雷腊嗨　宋立荣　中国科学院水生生物研究所　武汉４３００７２　摘要　论述了　数囊藻的分子进化，以生化蛆成卸细胞学特征为基础均各种苛娄方法；探访了擞　囊藻基因组：々性内韧障碍，总结了目前为止微囊藻基因克隆口所妥用趵方法；系统归纳了微　囊藻毒素合成酶基因的　究进展，指　了亍二屣微囊藻１分子遗传学的研究为重要性　关键词　微囊藻微囊藻毒素微囊藻毒素合成酶　随着内陆水体富营养化的加剧而引起的有害藻　控制　一”１．而对微囊藻分子生物学方面的研究则是　类水华的频繁发生已成为国内外普遍关注的环境问　近年来的热点之一．　题　，其中微囊藻水华是淡水水体中危害最＿皿重的　一类　Ｊ．我国是受这类水华影响最大的国家之一，　１微囊藻的分子进化和分类　巢湖，太湖，滇池等大型湖泊及各种池塘，在夏秋　分子生物学为破译遗传信息提供了新的工具，　季都会发生严重的水华，每年可长达７～８个月　可用于重新建立生物体的进化系统和分类系统、在　蓝藻水华在水面堆积，散发出鱼腥臭味，严重影响　蓝藻中，采用分子方法对各种遗传型之间关系研究　生态景观和旅游业，使饮用水质下降，水产养殖业　正在兴起　减产更为严重的是，微囊藻产生一种环状七肽肝　传统的微囊藻分类主要建立在形态学和细胞学　毒素，研究表明，该毒素是一种强烈的促癌剂。长　的特征上１］　，由于微囊藻形态表达的可变性，使微　期饮用含有微囊藻毒素的水可引发肝损伤甚至肝　囊藻种属水平的分类显得较为模糊，尤其是比较实　癌　Ｊ．在巴西所发生的一起严重的血透析书件。就　验室和野外样品时许多野外样品经过纯化转入实　是用了来自微囊藻毒素污染的水，患有肝炎的１２６　验室培养后，几乎都失去了群体形态而变成单细　个病人中，至少４３人死亡　虽然浮游动物和鱼　胞ｌ１　。　…，这使得建立在形态学上的分类令人质疑．　类对微囊藻毒素有较大的耐受性，但由于微囊藻毒　因而人们慢慢的将一些生化和分子方法引入微囊藻　素结构菲常稳定，常常在其体内富集和存留，并达　的分类．Ｋａｔｏ等　比较ｒ　３种２８株微囊藻中　到相当高的浓度，通过生态系统的食物链而对人类　ＩＤＨ，６ＰＧＤ，ＰＧＩ，ＰＧＭ的同工酶差异，建立了微　造成的潜在威胁更不可忽视　固此，为控制和消除　囊藻种间和种内同工酶基础上的基因型变化，认为　微囊藻水华，消除微囊藻毒索对人类健康的威胁，　绿色微囊藻和惠氏微囊藻分别有单一的固定的同工　对微囊藻的各种生物学特性进行分析研究显得十分　酶基因型，形态变化也几乎没有，铜绿微囊藻则分　必要．　为Ｓ和Ｌ．型．Ｆａｈｒｅｎｋｒｕｇ等［２　测定了包括微囊藻　在过去的几十年中．人们对微囊藻的研究主要　在内的大量蓝藻的ＤＮＡ碱基组成，认为微囊藻株　集中在　下几方面：（１）建立微囊藻毒素检测方　都有Ｇ＋Ｃ之间的相似的碱基组成，其摩尔分数为　法［５　；（２）观察各种环境固子及外界条件对毒素　０　３８－－０．４３．Ｋｒｕｇｅｒ等　认为脂肪酸组成可作为　产生的影响［９　“；（３）微囊藻及其毒素的生态毒理　微囊藻的一个分类指标，尤其可用在整个蓝藻门　效应＿１　ｔＳ］；（４）微囊藻水华发生的生物学机制及　中，但Ｏｔｓｕｋａ等　经分析比较２４株微囊藻的脂肪　２００１．０４．２０收稿，２００１　０５　２２收修改稿　国家自然科学基金（批准号：３９７３０３８０）和中国科学院生物科学与生物技术特别支持项目（ＳＴＺ　Ｄ１—３１）资助　＊联系凡．Ｆ￣ｍａｉ［：ｌｒｓｏｎｇ＠ｉｈｂ　ａｃ　ｃｎ　维普资讯 http://www.cqvip.com

自．篓科乎越展第１　２卷第４期２００２年４月　酸组成后，认为脂肪酸在一个种内的变化就很大，　因而并不适合作为分类指标．微囊藻产生的多糖ｒ　和凝集索及抗体　等细胞探针也被应用于微囊藻的　分类，前者仅讨论ｒ　６株微囊藻，根本不足以讨论　种的界定，后者的分类与形态分类不相符合，而与　这些种的地理分布更加接近　近年来，建立在１６Ｓ　ｒＤＮＡ，ｃｐｃ　ＢＡ．ＩＧＳ（藻蓝　蛋白　和Ｂ亚基基　及它们之间的间隔序列）等序列　被频繁地用于蓝藻（蓝细菌）的进化研究Ｎｅｉｌａｎ　等［　一和Ｏｔｓｕｋａ等　副建立了微囊藻在１６Ｓ　ｒＤＮＡ序　列基础上的系统进化树，但这个树没有反映建立在　形态基础上的分类系统．Ｒｕｄｉ等　除了应用１６Ｓ　ｒＤＮＡ的序列外，还比较了保守的ｒｂｃＬ和相对不保　守的ｒｂｏＸ基因，认为整个微囊藻是线形相关的，　１６Ｓ　ｒＤＮＡ和ｒｂｃｌ　ｘ的序列差异甚少Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ　等【３０　．Ｎｅｉｌａｎ等㈣和Ｏｔｓｕｋａ等［　都用ＰＣＲ．ＲＦＬＰ　的方法分析微囊藻的ｆｐｃ．ＢＡ．ＩＧＳ亭列，０ｔｓｕｋａ等　根据该序列的性内切模式将微囊藻分为８种基　凼型，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ认为该方法为蓝藻亚属水平的鉴　定提供了一个分子遗传标记大部分的遗传分析显　示微囊藻的形态特征和分子分析之间并无联系，　１６ｒＤＮＡ序列的显著相似和线形分析暗示微囊藻似　乎应整合为一个单一的种．Ｏｔｓｕｋａ［　一等应用１６Ｓ和　２３Ｓ　ｒＤＮＡ间隔区序列对４７株有毒和无毒徽囊藻进　行分析表明，微囊藻可分为３组，第１类既有有毒　也有无毒株，第２和第３类分别是仅有有毒株和仅　有无毒株．他们认为建立在该序列基础上的线性分　析对于了解亲源关系很近的种和株是非常有效的．　由于并非所有的微囊藻都产生微囊藻毒索，而　产毒和非产毒微囊藻在形态上并没有区别，因此，　在建立种种敏感的直接检测方法同时，人们也希望　在分子基础上将它们加　区分　Ｎｅｉｌａｎ等　Ｊ根据　１６Ｓ　ｒＤＮＡ的序列设计引物，扩增有毒和无毒微囊　藻的该基因，结果只是建立了一种敏感而特异的重　新分类微囊藻的方法随后Ｎｅｉｌａｎ＿　直接从多肽合　成酶和毒索合成酶基因中设计引物，初步探索了鱼　腥藻、束丝藻、颤藻、念珠藻、节球藻及徽囊藻等　产毒蓝藻中多肽合成酶基目的分布．在该基础上，　本实验室采用根据毒索合成酶基因ｍｃｙＢ设计的引　物　”Ｊ，经大量实验室和野外样品的检测证明，同时　与小鼠毒陛实验，ＥＩ　ＩＳＡ检测法和ＨＰＬＣ检测法的　结果相对照，该对引物可特异性的应用于产毒微囊　藻的检测．在此基础上，我们发展了水华蓝藻产毒　特性的全细胞ＰＣＲ检测法，它适用于不同来源的蓝　藻材料上述研究结果证明以ＤＮＡ为基础鉴别产毒　和非产毒微囊藻及其他水华蓝藻的方法是可行和实　用的，为产毒水华的早期预报和防治提供了新的技　术途径　微囊藻的分子分类和进化是对建立在细胞和形　态基础上分类和进化系统的深入和发展。对于蓝藻　的系统发生和分类地位的确定具有借鉴意义　２微囊藻基因组ＤＮＡ的特征及基因克隆　在利用蓝藻进行遗传学研究过程中，人们发现　某些蓝藻如织线藻、鱼腥藻、聚咆藻的基因组ＤＮＡ　完全不能或不能完全被某些性内切酶消化＿３　，　这可能是碱基的甲基化阻碍了内切酶或是蓝藻的基　因组ＤＮＡ中缺乏某些酶的酶切位点一般负责甲　基化的ｄａｍ和ｄｃｍ甲基化酶在蓝藻中都有报　道＿１　．甲基化酶使蓝藻基因组ＤＮＡ含有高比例的　修饰碱基，如ＭｅＣ，ＭｅＧ，这些碱基的存在封闭和　减少了甲基敏感性内切酶的酶切位点，造成了蓝藻　基因组ＤＮＡ的酶切障碍．微囊藻中也存在同样的　性内切障碍，Ｓａｋａｍｏｔｏ等［３７】用１３种性内　切酶消化铜绿微囊藻和绿色微囊藻，结果显示，微　囊藻基因组ＤＮＡ完全不被其中８种内切酶消化，　这主要是碱基被甲基化的结果　基因组相关的研究常常需要分离已知序列两侧　的未知片段，目前为止已发展了许多方法，经典的　有筛选基因组文库，现在被人们广泛选用的是由　ＰＣＲ衍生的一系列方法，如反向ＰＣＲ＿］　，连接接　头介导的ＰＣＲ＿１　．这些ＰＣＲ方法在ＰＣＲ前多需要　一些特殊步骤，如先Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交以决定合适的酶　切位点，然后酶切连接或加尾，很明显，酶切过程　了以上方法在微囊藻中应用．迄今为止，微囊　藻中基因的分离克隆普遍采用的是经典的筛选文库　法　，建立文库所用的内切酶主要是ＨｉｎｄＩＩＩ，　ＣｌａＩ，ＸｂａＩ，这几种酶消化的产物分子量往往非常　大，因而一般需建噬菌体文库采用筛选文库的方　法已成功地从微囊藻中分离到一些基因，如　ｒｐｏＤｌ，ｐｓｂＡ２，ｍｃｙＡＢＣＤＥＦＧ．Ｇｕｂｉｎ等　用微　囊藻基因组ＤＮＡ作为材料，探索了一种不经过酶　切而克隆侧翼序列的方法，这种方法类似于真桉生　物中普遍运用的基因克隆方法ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉ．　ｆｉｃａｔｉｏｎ　ｅＤＮＡ　Ｅｎｅ１），先用特异性单引物线形扩增基　因组ＤＮＡ，然后用末端核苷酸转移酶给扩增产物加　维普资讯 http://www.cqvip.com

３５２　自．鞋科学连展第１　２卷第４期２９０２年４月　尾，加尾片段用套式ＰＣ　Ｒ（Ｎｅｓｔ—ＰＣＲ）扩增出目的片　段，他采用该种方法克隆到ｔＲＮＡ　（ＵＡＡ）基因内　含子的上游和下游序列，此种方法目前还未有应用　于其他基因克隆的报道Ｊｉｍｂｏ和Ｍｉｔｓｕｒｕ　’。克隆　ｒ铜绿微囊藻Ｍ２２８的凝集素基因（ｒｅａ１），采用最　经典的基因克隆方法：首先分离得到蛋白，将蛋白　测序后，根据氯基酸序列推导核酸序列，设计引物　后ＰＣＲ扩增得到部分该基因，然后用体外克隆试剂　盒得到该基因的全序列　此种方法的缺点在于纯化　和测序蛋白费时费力且费用庞大，因而不足一种可　普遍应用的方法ＴＡＩＩ　一ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍａｌ　Ａｓｙｍｍｅｔ—　ｒｉｃａ】Ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ　ＰＣＲ）　是近几年发展起来的一种克　隆方法，它不需对基因组ＤＮＡ进行任何预处理，　且特异性强，本实验室已成功运用该方法克隆到微　囊藻已知序列的侧翼序列（结果待刊出），因而只要　引物台适，ＴＡＩＩ　一ＰＣＲ将有希望成为微囊藻中基因　克隆的一种简便工具　相对于整个基因克隆方法而言，已有的微囊藻　的基因克隆方法显得非常有限，因而应该在其研究　中　ｆ进或建立新方法，为微囊藻分子遗传学更深层　次的研究铺平道路　３微囊藻毒素合成酶基因的研究进展及基因　转移系统的建立　微囊藻的遗传分析起步于毒素合成酶基因的克　隆及其功能研究．１９９６年，Ｍｅｉ￣ｎｅｒ等　发现有毒　和无毒微囊藻中都含有与已知的多肽合成酶基因同　源的ＤＮＡ序列，他们假设微囊藻毒素的合成与许　多其他有机体中环状小肽的合成类似，是非核糖体　合成，由多功能酶复合体完成在此基础上，　Ｄｉｔｔｍａｎ等ｌ４　从徽囊藻中分离到一段称为ｍａｐｅｐ１　的ＤＮＡ片段，它特异地与产毒铜绿微囊藻杂交，　对这个片段的侧翼序列测序发现它们组成了一个多　肽合成酶基因族．随后，Ｄｉｔｔｍａｎ将ｍ　ｐｅｐ１克隆　到ｐＧＥＭ，Ｔ中，插入１　４　ｋｂ的氯霉素抗性基因盒，　所得的质粒转化含有ｄ。ｍ和ｄｃｍ甲基化位点的菌　株，纯化的质粒在体外用Ｓｓｓｌ甲基化酶甲基化　甲　基化的质粒直接与微囊藻混合１　ｈ后，涂于非抗性　培养平板，２　ｄ后加入氯霉素进行突变体的选择　２８　ｄ后，从６×１０　个微囊藻细胞中分离到５株突变　体这是首例微囊藻遗传转化并取得成功的报道．　经分析该突变体失去了产毒特性，由此证明该片段　参与了微囊藻毒素的合成．　近些年来，分析蓝藻生理和发育的遗传系统取　得了飞跃性的进展．随机转化法，电穿孔法和结合　转移法为许多蓝藻提供了有效的基因转移途径【　Ｊ．　基因转移与克隆和失活基因组合起来，为蓝藻的光　合作用、固氯、异形胞发育等方面的研究打开了一　扇宽敞的大门　然而，微囊藻似乎在转化和接合方　面存在障碍，经分析，微囊藻中存在ＩＩ型性内　切核酸酶　，并分泌到细胞外，这些内切核酸酶的　作用之一就是阻止外源ＤＮＡ的涉入．因此Ｄｉｔｔｍａｎ　发现没有甲基化的ＤＮＡ就没有成功的转化体，而　甲基化的ＤＮＡ的转化效率也非常低．Ｄｉｔｔ￣ｎ认　为，如要在徽囊藻中成功的进行基因转移，必须选　择桉酸酶活性低的藻株作为受体　另外，他建议氯　霉素基因是适于微囊藻基因功能研究的筛选标记基　因　在￣ｔｔｍａｎ的基础上，微囊藻的毒素合成酶基　因的研究及微囊藻的基因转移系统日趋完善起来　Ｎｉｓｈｉｚａｗａ＿４　根据多肽合成酶基因的腺苷酸形成区　域的保守氨基酸设计寡棱苷酸　ｆ物，在微囊藻中扩　增到的ＰＣＲ产物作为探针，筛选基因组文库．他将　克隆到的片段测序分析，发现了３个与微囊藻毒素　合成有关的基因：ｍｃｙＡ，ｍｃｙＢ，ｍｃｙＣ　ｍｃｙＡ全　长为８３６１　ｂｐ，ｍｃｙＢ位于ｍｃ－ｖＡ的下游１２ｂ口处，全　长为６３７８　ｂｐ，ｍｅｙＣ与ｍｃｙＢ有一个碱基的重叠，　即ｍｃｙＢ的终止密码子ＴＧＡ中的Ａ与ｍｃｙＣ起始　密码子ＡＴＧ共用，该阅读框为３８７０　ｂｐ．这３个基　因共同组成５个氨基酸的激活ｍｏｄｕｌｅ。即Ｍｄｈａ，　ｎＡｌａ．Ｌ—Ｌｅｕ，Ｄ－ＭｅＡｓｐ，Ｌ　Ａｒｇ．为了证明ｍｃｙ基　因的功能，ｍｃｙＡ中包括氨基酸激活和差向异构约　２．７ｋｂ的ＤＮＡ片段被突变，然后通过大肠杆菌一微　囊藻混合进行结合转移　这是不同于前面直接用质　粒转化的另一种基因转移系统　方法上也有所差　异，（１）氯霉素抗性基因盒中自身的启动子被切除，　换上的是Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＫ一８１基因ｒｐｏＤ１的启动子　Ｐ１和Ｐ２，该启动子在微囊藻中的转录表达非常强　烈，（２）转化质粒中被插入了ｍｏｂ基因，该基因可　使质粒高效率转移．分离到的突变株显示，该微囊　藻不再产生野生株的主要毒素上述研究并没有完　全鉴定微囊藻毒素合成的全基因结构，Ｎｉｓｈｉｚａ　ｗａ　仍然用筛选文库的方法克隆和测序了３４　ｋｈ的　产毒微囊藻ＤＮＡ片段，再次分离到４个基因：　ｍｃｙＤ，ｍｃｙＥ，ｍｃｙＦ，ｍｃｓＧ，这４个基因组成的　操纵子位于ｍｃｙＡ的上游，与ｍｃｙＡＢＣ组成的操纵　维普资讯 http://www.cqvip.com

自．鞋井荸皿展第１　２卷第４期２００２年４月　子方向相反基因ｍｃｙＢ，ｍｃｙＤ，，￣ｃｙＥ的插入突　变使该徽囊藻不再产生毒素经分析，ｍｃｙＤＥＦＧ　组成一个多酮类合成酶复合物，负责徽囊藻毒素结　构中Ａｄｄａ和谷氨酸的合成Ｔｉｌｌｅｔｔ［４５　Ｊ通过基因突　变和突变体分析，在一个长５５　ｋｂ　ＤＮＡ片段中找到　了两个操纵子，由１Ｏ个双向转录的开放阅读框组　成即ｍｃｙＡ—Ｃ和ｍｃｙＤ—Ｊ．在微囊藻毒素合成的４８　个顺序催化反应中，４５催化区域定位于６个多酶合　酶／合成酶（ＭｃｙＡ－Ｅ，Ｇ）中，它们将前体苯基乙酸，　丙二酰辅酶Ａ，Ｓ－腺苷甲硫氨酸，谷氨酸，丝氨酸，　丙氨酸，亮氨酸，Ｄ一甲基异一天冬氨酸和精氨酸转　移入毒素的合成中　另外４十基因为单体酶，蛋白　ＭｃｙＪ的作用为Ｏ甲基化，ＭｃｙＦ为差向异构，　ＭｃｙＩ为脱氢，ＭｃｖＨ为定位．这篇文章首次完全描　述了蓝藻复杂代谢物——微囊藻毒素的合成途径．　至此，微囊藻毒素合成酶基因的结构基本清楚，即　ｍｃｙＡＢＣ（多肽合成酶）和ｍｃｙＤＥ（杂合的多酮一多肽　合成酶）两个主要操纵子，另外还有修饰辅助基因．　Ｔｉｌｌｅｔｔ同时用自然转化和电转化作为突变株的筛选　发现，电转化可使突变株筛选的成功率提高近１５０　倍　微囊藻毒素合成酶基因的分离和功能研究不仅　揭示了微囊藻毒素合成的遗传基础。还在微囊藻中　建立了基因转移系统，为在徽囊藻中开展其他基因　的功能研究奠定了一定的基础，但两种基因转移系　统的效率都很低（前者得到６个突变克隆，后者得　到４个）．因此，徽囊藻的基因转移系统还有待完　善和改进．　４展望　微囊藻的分子生物学发展到今天，虽然微囊藻　毒素合成的基因构成已基本清楚，但对整个徽囊藻　属而言，它的遗传背景几乎是一片空白　已经分离　报道的基因屈指可数，研究方法相对于整个现代分　子生物学方法而言，显得非常滞后，这可能是　下　原因造成的：（１）徽囊藻是一种产毒蓝藻，且毒素　的危害性很大，因而对毒素的分离，检测，毒理研　究及生理等方面首先吸引了人们的关注；（２）　微囊藻可在富营养化的湘泊中暴发成水华，造成多　方面的危害，所以人们的一部分视线又投入徽囊藻　水华的控制和治理；（３）徽囊藻的基因组ＤＮＡ的限　制性内切障碍特别强，且产生几种性内切酶，　这使许多常用的方法往往难以应用，因而增加了研　究的难度，使研究进度缓慢；（４）自然状态的徽囊　藻以群体存在，它的胶鞘坚韧，为多种酶所不能消　化，因而不管对生理生化还是分子生物学研究，都　是一道障碍．　微囊藻水华现在已是世界性环境问题，它给环　境带来的灾难和对人类健康的危害倍受关注，上个　世纪人们从各个方面对微囊藻进行了广泛的了解和　研究，但仍有许多谜团有待解决．毒索的生物学和　生态学功能一直是人们感兴趣的问题，但长期以来　并没有实质性的进展，随着微囊藻分子生物学的发　展，更多的产毒突变株的获得，将会为深入地认识　毒素的功能提供直接的证据　虽然目前已经有特异　引物能够区分产毒和非产毒徽囊藻，但并不能将其　应用于其他产毒蓝藻，因而需进一步发展其他常见　水华蓝藻的分子鉴定．可以预期，对这些问题的解　决，不仅推动蓝藻分子生物学的发展，同时也将有　助于了解水华蓝藻产生和暴发的生物学机制及其控　制．　随着人类基因组全序列的测定和简图的公布，　其他物种基因组学的研究也在纷纷进行　目前为　止，　已有Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ＰＣＣ６８０３和Ａｌ＂ｌａｂａｅｎａ　ＰＣＣ７１２０两种蓝藻的基因组全序列公布，前者作为　研究光合作用的模式种，后者作为研究发育的模式　种，已掀起了对这两种蓝藻基因功能的研究热潮．　前不久，法国巴士德研究所的Ｎｉｅｏｌｅ　Ｔａｎｄｅａｕ　ｄｅ　Ｍａｒｓａｃ博士在Ｃｙａｎｏ　Ｎｅｗｓ上发布消息，宣布她正　在和一些公司合作着手进行铜绿微囊藻基因组计　划可以预期，随着徽囊藻基因组全序列的完成，　微囊藻基因功能研究的兴起，也将会为控制和消除　微囊藻水华提供更多借鉴和途径　参考文献　１　Ｈ０ｌｌｅｇｅｆｆ　Ｇ　Ｍ　Ａ　ｒｅｖｉｅｗ　ｈａｒｍｆｕｌ　驴Ｉ　ｂｂ。ｍ　ａｎｄ　ｔｈｏｒ　ａｐｐａｒ印ｔ　ｇｂｂａＩ　ｉｎｃｒ￣ｓｅ　Ｐｈｙｃｏｌｅｇｉａ，１９９３，３２（２）：７９　２　Ｗａｔ￣ａｂｅＭ　Ｆ．ｅｒ　ａｌ　Ｔｏｎｃ，￣Ｉｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　Ｂ。ｃａＲａｔｏｎｔ　ＣＲＣＰｒ　ｓ。　１９９６　３　Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ　Ｍ　Ｒ．ｅｔ　ａｉ　Ｌｉｖｅｒ　ｔＨｍｏｒ　ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｈｙ　ｔｈｅ　Ｃｙａｎｏｂａｃｔ￣ｒｉａ　ｃｙｃｌｉｃ　ｐ印ｔ】　ｔｏｘｉｎ　ｍｉｅ￣ｙｓｔｉｎ－ＬＲ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　Ｃｉｉｎ　Ｏｎｍ１．　１９９２．１１８：４２０　４　Ｊｏｃｈｉｍｓｅｎ　Ｅ　Ｍ．ｅｔ　ａ１．１ａｖｅｒ　ｆ￣ｕｌｕｒｅ　ａｎｄ　ｄｅａｔｈ　ａｆｔｅｒ㈣ｕｒｅ　ｔｏ　ｍｌ—　ｃｒ￣ｙｓｔｉｎ　ａｔ　ａ　ｈｅｍｒ￣ｌｉａｌｙｓｉｓ睫ｎｔｅｒ　ｉｎ　Ｂｒｏｉｌ　Ｎｅｗ　Ｅｎｌｇｉ　Ｊ　Ｍｅｄ，　１９９８，３３８：８７３　５　Ｊｕｓｓｉ　Ｍ　Ｃｈｍｍａｔｃｇｒａｐｈｙ　ｏｆ…ｖｎ　Ｌｎｓ　Ａｎａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｅａ　Ａｃｔａ．　１９９７．３５２：２７７　６　Ｗａｒｄ　Ｃ　Ｊ，ｅｔ　Ｃｏｌｏｒ／ｍｅｍｃ　ｐｒｏｔｏｎ　ｐｂｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎ￣ｂｉｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　维普资讯 http://www.cqvip.com

自燕科荸ｉ建，展第１　２卷第４期３００２年４月　Ｉ　ｂ。ｒ缸ｏｒｖ　ｓｔｒｍｎｓ　ａｎｄ　ｎａｔｕｒａｌ　ｂｌｏｏｍｓ　ｏｆ　ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｌａ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　ｗｉｔｈ　ｈｌｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃ￣Ｉｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｒｎａｔｏｇｍｐｈ＠ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｍｉｃｆｏ—　ｃｙｓｔｉ￣ＦＥＭＳ　Ｍｉ￣ｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．１９９７，１５３：４６５　７　Ｃｈｕ　Ｆ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ　Ｅ￣ｙｍｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓ￣ｇ　ｆｆ】　ｍｉ。　ｃｙｓｔｉ￣ｉｎ　ｂｌｕｅ－ｇｒｅｅｎ　ａｌｇａｌ　ｈｉ．ｍｓ　Ｊ　Ａｓｓｏｃ　Ｏｆｆ，ａｍｄｙｔ　Ｃｈｅｍ，１９９０、　７３：４５１　８　Ｏｎｙｅｗｕｅｎｙｉ　Ｎ．ｅｔ　ａｌ　８ｅｐ￣ａｔ［ｏｎ　ｏｆ　ｔｏｘｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ（ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｓ）ｉｎ　ｃａｐｉｔｌａｒｙ　ｅ￣ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｒｉｓ，　ｎｈ　ｔｈｅ　ａｉｄ。ｆ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｍｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｍｏｄｉ　ｉｔｅｒｓ　Ｊ　Ｃｈｍｍａｔｏｇｒ．１９９５．７４９：２７１　９　Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｍ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ　Ｅｆｆｅ￣ｔｓ　ｏｆ㈣…　ｆａｃｔｏｒｓ　０【Ｉ　ｔｏｘｉｃｉｔｖ…ｆ　ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｎｕｍ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉ＊ａｅｒｕｇｉｎｏ￣）ｕｎｄｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｏｒｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ［，１９８５．４９：１　３４２　１０　１４丑ｎｓ　Ｕ，ｅｔ　ａｌ　Ｉｍｎ　ｓｔｉｍｕ［ａｔｅｄ　ｔｏｘｉｎ　ｐｒｔ￣ｄｕｃｎｏｎ　ｉｎ　Ｍｉｃ　ｗｆｉ　㈣ｇｉ㈣ＡｐｐＩ　Ｅｎｖｉ￣Ｍｉｃｍｂｉｏ［，１９９５，６１：７９７　１１　Ｓｏｎｇ　Ｌ．ｅｔ　Ｍｉｃ￣ｖｓｔ　ｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒ￣ｔｉｓ　ｕｎｄｌｓ　（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅ／￣ａ）ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｕｈｕ￣ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　Ｉ　ｈｖ∞】Ｒｅｓ．　１９９８，４６（Ｓｕｐｐ［）：１９　１２　Ｄａｗ￣ｎ　Ｒ　Ｍ　Ｔｈｅ　ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｍｉｅｍｃｙｓｔｉｎｓ　Ｔｏｘｉｃｏｎ，１９９８，　３６：８５３　１３　Ｄａｎｉｅｌａ　Ｂ．ｅｔ　ａ１．Ｉｍｐａｃ￣ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｙａｎｏｈｓｃｔｅｒｌａ　ｔｏｘｉｎ　ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ　ＬＲ　。ｎ　ｂｅｈａｖｉｏｕｒ　ｏｆ￣ｂｒａｆｉｓｈ，Ｄａｎｉｏ　ｒ￣ｒｉｏ　Ｗａｔ　Ｒｅｓ，１９９８，３２　９４８　１４　Ｒｏｈｒｌａｃｋ　Ｔ．ｅｔ　Ｒｏｌｅ　ｉｆ　ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｓ　ｉｎ　ｔｘｆｉｍｎｉｎｇ　ａｎｄ｛（ｘ＿ｄ　ｉｎｇｅｓ—　ｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄａｐｈｎｉａ　ｇａ］ｅａｔａ…ｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｍｉ　ｃｒ￣＇ｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇ￣ｎｏｍ　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｏｒｎ　Ｍ…ｂ　】．１９９９．６５　７３７　１５李效宇，等微囊藻毒索的声生．检测和毒理学研究水生生　蛔学报，１９９９．２３（５）：５１７　１６　Ｐａｒｋｅｒ　Ｄ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｓ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｇｔｏｖ￣ｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｙａｎｏｂａｃｔｅ．　ｒｉａ　Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐｐ　ｉｎ　ｐｏｎｄ　ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉａ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｃｏｎｒ￣ｌ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｅｙｓｔｉｎ—ｐｒｏｄｄｉｎｇ　ａｑｕａｔｉｃ　ｂＪ￣ｍｓ　Ｅｎｖｉｒａａ　Ｍｉｃｍｂｌｏｔ．１９９７，６３：２３２４　１７万登榜．等污球稳定塘除藻的可　性技术　究应用与环境　微生物学报，１９９９、５（增刊）：８４　１８　Ｒｉｐｐｋａ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ　Ｇｅｎｅｒｉｃ　ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ．ｓｔｒａｉｎ　ｈｉｓｔｏｒｉｅ￣ｅ，ｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｕｒｅ　ｃｕｈｕｒｅ　ｏｆ　ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ　Ｊ　Ｇｅｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ［．１９７９、１１１　１　１９　Ｈｏｔｍ　Ｈａｎｓｅｎ　Ｏ　Ｒｅｔｅｍ　ａｄｖｉｃｅ　ｍ　ｔ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｂｌｕｅ　ｇｒｅｅｎ　ａｔ　ｇａｅ　Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｓｙｍｐｃｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｒｅｑｕｉ￣ｍｅｍ　。ｆ　Ｂ１　Ｇｒｅｅｎ￣ａｄｇａｅ　Ｃｏｒｖａ　ＬＬｉｓ，Ｏｒｅｇｏｎ、Ｆｅｄ　Ｗ￣ｔｅｒ　Ｐｏ【Ｊｕｔ　Ｃｏｎ　ｔｒｏｌ　Ａｄｚ１，Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｎｏｒｔｈｗ￣ｔ　Ｗａ［ｅｒ　Ｌａｂ．１９６７　８７　２０　Ｐａｒｋｅｒ　Ｄ　Ｌ　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃ［ｏｎｉｔＲｇ　ａｎｄ　ｐｕｒｌｆｉｃａｆｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ｃｕ［ｔｕｒ￣（Ｃｙａｎｏｐｈ　ａ）Ｊ　Ｐｈｙｃｏｌ、１９８２．１８：４７１　２１　Ｋａｔｏ　Ｔ，ｅｔ　ＡＩ　Ｌ￣ｙｍｅ　ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｍｉｃ￣ｃｙｓｔｉｓ（Ｃｙａｎｏｐｈｙｃｅａｅ）　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｔａｘｏｎｏｒｍｃ　ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ　Ａｒｃｈ　Ｈｙｄｒｏｂｉｏ［Ｓｕｐｐ［　ｇ　Ｓｔｕｄ，　１９９１．６４：１２９　２２　Ｙａｈｒ￣ｋｒｕｇ　Ｐ　Ｍ．ｅｔ　Ｂａｓｅ　ｃｏｍｐｃｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｓｄｅｃｔｅｄ　ｓｔｒａｉ￣ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ［ｇｅｎｕｓ　Ｍｉｃｍｃｙｍｓ　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｓｙｓｔ　Ｂａｃｔｅｒｌｏ１．　１９９２，４２：１８２　２３　Ｋｒｕｇｅｒ　Ｇ　Ｈ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ　Ｆａ　ｔｙ　ａｃｉｄ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｍｎ　ａｓ　ａ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｃｈａｒａｃ　ｔｅｔＪｓｔｉｅ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ￣ｃｏｉｄ　ｃｙ￣ｎｏｂａｃｔｅｒｌａ（ｂｌｕｅ　ｇｒｅｔａ　￣ｌｇａ）ｉｍｔａｔｅｓ　Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ．１９９５，３０８：】４５　２４　Ｏ＊ｓｕｋａ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ…　ｐｅｃ　Ｌｅｓ　ａｎｄ　ｓｔｒａｉｔ￣ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　Ｍｋ－ｒｏｃ￣ｔｉｓ（Ｃｙａｎｏｂａｃｔ￣ｉａ［）ｆｏｒ　ａ　ｒｅｃｏ￣ｉｄｅｍｒｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐ￣ｉｅｓ　ｅｌａｓｓｉｆｉｃｍｉｏｎ　Ｐｈｙｍ　Ｒｅｓ．１９９９，４７：１８９　２５　Ｆｏｒｎｉ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ　Ｃｏｒｎｐａｒ￣ｔｉｖｅ　ａｎａ［ｙｓｋｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｔ　ｖｓａｃｃｈａ￣ｄｅｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｐｅｃｉｍ　ｏｆ　Ｍ　ｚ　５　ＬＣｈｒｏｏｃｏｃｃｈｅｎｄｅｓ，Ｃｙ￣ｎｏｐｈｙ一　诅）Ｐｈｙｅａｌｇｎｉａ，１９９７．３６：１　８１　２６　Ｌｏｐｅｚ　Ｒｏｄ￣Ｖ．　ｔ＆ｌ＿Ｃｈｅｒ￣ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈ０ｓｐｅｃＬｅｓ　ａｎｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ垤ｆ，　ｆ￡　（ｃｙａｎｏｈｅｃｔｅｒｉａ）ｆｒｏｍ　ｔｍｔｕｒ￣［ｐｏｐｕ￣ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｌａｂｏｒａ＇ｔｏ—　ｒｙ　ｃｂ　ｓ　ｕｓｉｎｇ　ｃｄｔ　ｐｍｈｅｏ（１ｅｃｆｎｓ　ａｎｄ　ａｍ１ｂ。出鹧）Ｊ　Ｐｈｙｃｄ，１９９７．　３３：４４６　２７　Ｎｅｄａｎ　Ｂ　Ａ，ｅｔ　ｒＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｅｍ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｔｍｒｙ　ｒｅｔａｔｉｏｎ￣ｈｌｐｓ　ａ　ｍｏｎｇ　ｔｏｘｉｃ　ａｎｄ　ｎｏｎｔｏｘｉｃ　ｃＦａｎｏｈａｅｔｅｆｉａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ№ｍｔ　ｆ　Ｉ　ｎＴ　Ｊ　Ｓｙｓｔ　Ｂａｃｔｅｆｉｏ［，１９９７，４７：６９３　２８　Ｏｔｓｕｋａ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ　１６ＳｒＤＮＡ。　…ａｎｄ　ｐｈｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａ∞　ｍｓ　ｏｆ　Ｍｉｃ￣ｙｓｔｉｓ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ａｎｄ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｎｎ．ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏ．　ｈｉｏ【ＬＨｔ，１９９８．１６４：１１９　２９　Ｒｕｄｉ　Ｋ，ｅｔ　Ｅｖｏｉｍｉｏｎ　ｏｆ　ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ　ｂｙ　ｅｘｃｈａｔ￣ｅ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｎａｔｅｒｌａＩ　ａｍｏｎｇ　ｐｈｙｌｅｔｉｃａｌ［ｙ　ｒｅｎｔｅｄ￣ｔｒａｉｎｓ　Ｊ　Ｂａｅｔｅｎｏ［，１９９８，１８０：　３４５３　３０　Ｃｈｎｓｚｏｐｈｅｒ　Ｊ　Ｓ　Ｂ，ｅｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎｓ。ｆ　ｅｙａｎｏｈｅｃｔｅｒｌａ　ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲ－ＲＦＬＰ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｐｃＢＡ　ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｅ　ｓｐａｃｅｒ　ａｎｄ　ｆＬａｎｋｍｇ　００ｎｓ　Ｊ　Ｐｈｙｃｏ１　１９９６．３２：４４５　３１　Ｎｅｉｌａｎ　Ｂ　Ａ．ｅＩ　ｅＧｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ｏｆ　ｔｏｘｉｃ　ｃｙａｎｏ￣ｃｔｅｒｉａ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂ３ｒ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｏ／３￣ｈｉｓｍｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｋ　ｖｈｒ￣ｏ　ｅｖａｎｌｎ　１。ｃｕｓ　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｍｂｉｏ１．１９９５．６１：３８７５　３２　Ｏｔｓｕｋａ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ　Ｐｈｙ［ｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｏｘｉｃ　ａｎｄ…　ｔＯＸｉＣ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇ…Ｍｉｃｒ￣ｙｓｄｓ　ｂ∞ｅｄ　ｎｉｔ　１６Ｓ　ｔｏ　２３Ｓ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｒｍｓｃ＊ｉｂｅｄ　ｓｐａ￣ｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．１９９９，１７２：　１５　３３　Ｎｅｉｌａｎ　Ｂ　Ａ，　ｔ　…ｂ。∞ｍ　ｐｅｐｓｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｏｘｉｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｃｙａｎｏｈｅｃｔｅｎａ　Ｊ　Ｂａｃｚｅｎｄ．１９９９，１８１：４０８９　３　潘卉，等水华蓝藻产毒特性的ＰＣＲ拉测法术生生榭学报．　２００１，２５（２）：１５９　３５　Ｐａｄｈｙ　Ｒ　Ｎ，ｅｔ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｔｔ卸ａ［ｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｉｎｔｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ｂ豁晤ｏｆ　ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　ａｔｔｄ　ｕｎｉｃｅＨｕｌａｒ　ｃｙ￣ｏｂａｃｔｅｎａｌ　ＤＮＡｓ．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ［．１９８８，１７０：１９３４　３６　Ｌａｍ　ｎ　Ｇ　Ｒ　ｅｔ　ａ【Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｆｉｌｎｍｅｔｔｔｏ￣ａｎｄ　ｕｎｉ　ｅｅＨｕｌａｒ　ｅｙａｎｏｈ￣．１ｅｒｌａ　ｔｏ　ｍｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｄｅａｓｅ　ｄｅ￣ｖａｇｅ　Ｂｉ￣ｈｌｍ　Ｂｉｏｐｈｙ￣Ａｃｔａ．１９８４．７８１；４５　３７　Ｓ￣ｋａｎｗｔｏ　Ｔ，ｅｔ　ａ【Ｃｈｅｒａｃｔｅｒｉｓｔｉ￣ｏ１　ＤＮＡ　ａｎｄ　ｍｕｈｉｐｉｅ　ｒｐｏＤ　ｈｏ．　ｍｏｌｏｇｓ　ｏｆ．￣ｆｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｔｒａｈ￣Ｉｎｔ　Ｊ　Ｓｙｓｔ　ｌ￣．ｃｔｅｆｉｏ１．　１９９３，４３：８４４　３８　ｏｃｈｍａｎ　Ｈ。ｅｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｐｐｌｋ￣ｔｉｃｃｔｓ　０ｆ　ａｎ　ｈｗｅｔｓｅ　ｐｃ１　—　ｃｈｅｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９８８，１２０：６２１　３９　Ｉｓｅｇａｗａ　Ｙ．ｅｔ　ａｌ　Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ａｍｐ［ｉｆｉｃａｔｉｏｔｔ　ｏｆ　ｅＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｆｒｏｍ　ｔｏ—　ｔａｔ　ＲＮＡ　ｂｙ　ｃａｓｓｅｔｔ￣］ｉｇａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｏｏｌｖｎ　ｃｈｅｈａ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　（ＰＣＲ）：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　６　５　ｋｂ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｇｍｅａｔ　ｏｆ　ｂａｎ．　ｔａｖｉｒｕｓ　ｓｔｒａｉｎ　Ｂ＿１　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｂｅｓ，１９９２．６：４６７　４０　Ａ￣ａｙａｍａ　Ｍ。ｅｔ　ａｌ　ＣＩｏｎｈａｇ．ｓｅｑｕ￣ｃｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　ｍａ｛ａｃｔｏｒ　ｈｏｍｏｌｏｇ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｙａｎｏｂａｃ．　ｔｅｒｉｕｍ　Ｍｉｃｒｏｃ￣ｔｉｓ㈣　Ｋ－８１　Ｇｅｎｅ，１９９６。１８１：２ｌ３　４１　Ｓａｔｏ　Ｍ・ｅｔ　Ｌｉｇｈｔ　ｒ￣ｐｏｔｍｉｖｅ　ａｎｄ　ｒｈｙｔｈｍｉｃ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｓ　ｈＡ２　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自．整井荸地展第１２卷第４期２００２年４月　ｇ朗ｅ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ｒｅ。ｐ。ｎ　ｅ　ｆｏｒ　ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｙ卸０ｂａｃ　ｔｅｒｉｎｍ　Ｍｉｃｒｎ　２６：７７９　ｑｕｅｎｃ￣Ｂ∽ｅｃｈⅢｑｌｍ．１９９９，２７：ｌ１７０　￣ｕｇｉｎｏｓａ　ＰＣＣ　７８０６　ＭｏＩ　Ｍｉｃｍｂｉｎ［，１９９７，　４７　Ｊｈａｂｏ　Ｍ，ｅｔ　ａｔ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｉｃ￣ｙｓｔｉｓ“　ｇ…Ｍ２２８［ｅｃｔｉｎ　（ＭＡＬ）ｇｅｎｅ　Ｂｉ￣ｈｅｍ　Ｂ［ｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　ＣＡ：ｙｍｒｒｔｌｌｌ１．２０００，２７３：４９９　ｇｅｎｅｓ　４８　Ｉ．【ｕ　Ｙ　Ｇ，　Ｔｈｅｒｍａｌ　ａｓｙｍｍｅｔｉｃ　ｉｒｎｔｅｒｌａｃｅｄ　ＰＣＲ：Ａｕｔｏｍａｔａｂｌｅ　ｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　６一Ｐｌ　ａｎｄ　４３　Ｎｉｓｈｉｚａｗａ　Ｔ　ｅｔ　３１　Ｇｅｎｅｔｉｃ帅ａ　Ｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｐｔＪｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｔ￣ｆｏｒ　ａ　ｃｙｃｌｉｃ　ｈｅｐｍｐｅｐｔｉｄｅ　Ｍｉ￣ｒｏｃｙｓｔｍ　ｉｎⅫｃｍ　１９９９．１２６：５２８　ｓｐｐ　Ｊ　Ｂ￣ｏｃｈｅｍ，　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ￣ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｉｔ￣ｒｔ　ＹＡＣ　ｃｌｏｎｅｓ　ｆｏｒ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｗａｌｋｉｎｇ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９５，２５：６７４　４４　Ｎｇ￣ｚａｗａ　Ｔ，ｅｃ　ａｌ　Ｐｏｌｙｋｅｔ［ｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ｇｏｎｅ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｅｐ－　ｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｔ￣ｍｏｄｕｌｅ　ｉｎｖｏｈ＇ｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂ［ｏｓｙｎｔｈ￣ｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｙｃｌｉｃ　ｈｅｐ—　４９　Ｍ￣ｆｌｎｅｒ　Ｋ．ｅｔ　Ｍｉｃｔｔ￣，ｓｔｉｓ“　ｓｙｎｔｈｅｔ￣ｇ—Ｔｏｘｉｃ　ａｎｄ　ｎｏｎ－ｔｏｘｉｃ　ｓｔｒａｉｎｓ。ｆ　ｔｈｅ　ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　０舳￣ｎｔａｍ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｔｏ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎ　ＭＳ　Ｍｉｃｒｏｈ［ｏ［Ｌｅｔｔ，１９９６．１３５：２９５　ｔａｐｅｐｔｉｄｅ　Ｍｉｃ￣ｙｓｔｉｎ．Ｊ　Ｂ［￣ｈｅｒａ，２０００，１２７：７７９　４５　Ｔｉｌ］ｅｔｔ　Ｄ．ｅｔ　ａｌ　Ｓｔｒｕｃｔ￣ａ［ｏｒｇａｎ［￣ｔｉｎｎ　ｍｉｅ￣ｙｓｔｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｍ　ａｅｒｕｇ／￣ＰＣＣ７８０６：柚ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｐｅｐｔ［ｄｅ￣ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎ　５０　Ｂｒｙ￣ｔ　Ｄ　Ａ　Ｔ　Ｍ　ｅｃ　ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ａｄ…ｅｓ　ｉｎ　Ｐｈ毗０ｓｙｎ【ｈ　ｌｓ）Ｋｌｕｗｅｒ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９４　５ｌ　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｉ．ｅｔ　ｍ　ｌ　Ｒ￣ｔｒｉｃｔｉｎｎ　ｂａｒｒｉｅｒ∞ｍｐ　ｄ　ｏｆ柚　。ｅｌ　ｒ　ｔｈｅｔａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ　Ｃｈｅｍ　Ｂｉｎ［，２０００，７：７５３　４６　Ｇｕｂ［ｎ　Ａ　Ｎ．ｅｔ　ａ１．Ｒｅｓｔｒ［ｃｔｉｎｎ　ｃｕｔｔｉｎｇ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｇｅｎｏｒｍｅ　ＤＮＡ　ｓｅｇｒｎｅｍｓ　ｏｕｔｓｉｄｅ　ｔｈｅ　ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ　０ｆ　ｋｎｏｗｎ　ｓｅ—　ａｎｄ￣ｓｔｒｉｃｔａｏｎ　ｅｎｄ０Ⅱｌ　【…ｉｎ　ｔｈｅ　ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙ￣ｏｂａｅｔｅｒ［－　ｕｒｎ　Ｍｉ￣ｏｃｙｓｔｉｓ印ＦＥＭＳ　Ｍｉｎｒｏｂｌｏ［Ｌｅｔｔ，１９９６，１４５：１０７　从雪中送炭到星火燎原——中国循证医学的发展道路　循证医学（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＥＢＭ）是遵循科学证据的医学，近十余年来在临床医学实践中发　展起来的一门新兴学科，目前十分的活跃，引起全世界医学界的重视。　循证医学在我国开始于１９９６年，由原华西医科大学刘鸣副教授从英国留学归国之后提出筹建中国循证　医学中心的动议，得到校、院两级和当时的卫生部陈敏章的大力支持。　国家自然科学基金委员会也对循证医学研究在我国的启动给予高度重视，拨款４万元资助了首届中国　国际循证医学研讨会，会后与会议澳大利亚的Ｃ，Ｓｉｌａｇｙ教授就循证医学在中国的发展进行了深入的讨　论。１９９７年１１月，中国循证医学中心在原华西医科大学成立，１９９９年３月国际循证医学中心批准中国中　心注册为第１３个中心，也是亚洲第１个，亚太地区第２个被批准的中心。中国中心主任李幼平教授被遵选　为国际循证医学协作网的１４人指导委员会成员之一，是该委员会惟一的亚洲代表。　此后．中国的循证医学研究得到了美国纽约中华医学基金会（ＣＭＢ）、中澳（澳大利亚）双边台作项目　（ＡｕｓＡｉｄ）和世界卫生组织（ＷＨＯ）项目的资助。中国中心成立５年来，举办全国ｌ６期，培训来自全　国２９个省市自治区及特区８Ｏ余个专业的４６７２名医生和科研人员；６８个中华医学系列杂志１１４名主编　及２４个省、市、自治区卫生厅局的１３１名管理干部。在全国１０多个城市巡回讲演７Ｏ余场，听众约８０００人　次。第一批启动了２３项研究项目。２００１年创刊《中国循证医学）杂志，并被教育部批准为内科学下的循证医　学研究方向，培养硕士、博士和作博士后研究。　５年来，在循证医学的研究中开展了积极的国际合作，先后邀请德国、美国、英国、瑞典和澳大利亚的　专家访华并讲学。中国中心也派多人出国学习、培训和研究。目前正在筹建北京、上海、等地区分中　心。　目前．循证医学的研究已渗透到了临床医学、药学、中医药学、卫生技术评估、临床试验各个方面，　将在全国范围内把临床的教治水平、药品的监督管理、科学研究的质量提高到一个新的水平。雪中送炭的４　万元换来了星火燎原的大好局面，为我国医学、药学、中医药学走向世界打下了巩固的基础。　（供稿：张风珠、叶鑫生）