省自然科学基金

立项依据和目标：

1、本课题研究意义及同类研究工作国内外研究现状、知识产权状况与存在问题，并列出主要参考文献：

阿尔茨海默尔病（Alzheimer disease, AD) 是一种渐进性大脑退行性病变，是最常见的成年痴呆症，其发病率随年龄增长急剧增高。由于AD患者常伴有不同程度的认知障碍，生活不能自理，不但严重影响患者本身的生活质量，还给家庭和社会带来沉重负担。因此，AD是当今公认的医学和社会学难题，已引起各国和有关研究人员的广泛重视。

AD患者脑的两大特征性病理改变是大量的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)和老年斑（senile plaque, SP)，前者是AD患者神经元退化的病理基础，其数量与患者的痴呆程度正相关[1]。NFT的主要成份是异常过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的双螺旋丝（paired helical filaments, PHF)[2]。Tau蛋白是主要表达在神经细胞的一种微管相关蛋白，其主要生物学功能是结合、刺激微管的组装和稳定微管结构。当tau蛋白被过度异常磷酸化后，即失去其生物学功能[3]。 因此， tau蛋白的磷酸化被认为是AD致病过程中的关键事件，控制tau蛋白磷酸化水平成为AD防治研究中极其活跃的领域。

O-GlcNAc糖基化是一种新近发现的、广泛发生在细胞质和细胞核内的、动态的蛋白质翻译后修饰方式，它是在多肽链的丝氨酸或苏氨酸残基上接有一个N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-glucosamine, GlcNAc)[4]。从特性上看，它更象磷酸化修饰，而不象经典糖基化修饰，后者在正常情况下在内质网和高尔基体中进行，只修饰分泌蛋白和膜结合蛋白。O-GlcNAc糖基化与磷酸化修饰相同或相邻的位点，现今发现的O-GlcNAc糖基化蛋白质都是磷蛋白[5], 越来越多的证据证明蛋白质的O-GlcNAc糖基化和磷酸化是信号转导途径中两种方式，它们是相互竞争又相互补充的，它涉及对许多细胞功能包括转录、蛋白

质合成、神经纤维的组装和癌基因的激活等多种细胞功能活动的调节[6]。

与蛋白质的磷酸化受蛋白激酶和磷酸酯酶的双重相似，蛋白质的O-GlcNAc糖基化程度也是O-GlcNAc糖基转移酶（OGT）和O-GlcNAc糖苷酶共同作用的结果[7]。O-GlcNAc糖基转移酶是催化GlcNAc连接到肽链的丝氨酸或苏氨酸残基上的酶，UDP-GlcNAc是它的供体底物。最近的研究显示UDP-GlcNAc除了可作为底物控制糖基化程度外，它还调节性使蛋白质O-GlcNAc糖基化程度明显增强。

tau蛋白是一磷蛋白，它有高达数十个潜在磷酸化位点，已证明在AD患者脑tau蛋白中，有21个位点被磷酸化[11]。Hart 实验室首先证实牛脑tau蛋白的O-GlcNAc糖基化[12]，本人最近从正常人脑组织中免疫沉淀tau蛋白，首次证实了人脑tau蛋白也被O-GlcNAc糖基化(待发表资料)。不断增加的信息，如:在AD病人的脑中，葡萄糖的转运和利用呈现区域性的减少[13]， 在AD病人脑的PHF结构中，没有O-GlcNAc糖基化存在[14]，饥饿引起tau蛋白的AD样异常磷酸化[15]，从培养介质中移去葡萄糖引起海马细胞的NFT样抗原的产生[16]，与细胞内葡萄糖浓度的降低引起的UDP-GlcNAc浓度下降，进而影响O-GlcNAc糖基化水平有关[17-19]，提示O-GlcNAc糖基化极其可能是影响tau蛋白磷酸化的重要因素，但一直未见有直接的证明。因此，tau蛋白的O-GlcNAc糖基化与磷酸化是否也象其他蛋白那样，存在竞争或互补关系的研究，对于揭示AD的发病机制是一极其有意义的课题，并可能为AD的预防和治疗提供有价值基础研究依据。

参考文献

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2、本课题的研究内容、研究目标和拟解决的关键问题；

研究内容：

通过低糖或饥饿处理细胞或动物，建立表达AD样tau异常磷酸化的细胞和动物模型。

探讨低糖或饥饿处理是否降低神经细胞的UDP-GlcNAc的水平、OGT的活性、细胞总蛋白尤其是tau蛋白的O-GlcNAc糖基化程度。

降低神经细胞的O-GlcNAc糖基化水平而不降低细胞内葡萄糖浓度，观测tau蛋白的磷酸化程度和AD样异常磷酸化位点，以排除由于低糖引起的其它反应。

探讨增高细胞内O-GlcNAc糖基化的可能途径，分析tau蛋白的磷酸化程度和AD样磷酸化位点，以从相反的方面进一步探讨O-GlcNAc糖基化对tau蛋白磷酸化的影响。

研究目标:

分别在细胞和整体水平，探讨 tau蛋白O-GlcNAc糖基化与 其AD样异常过度磷酸化的关系，从理论上更深入地揭示AD发病机制，为AD的防治提供新思路、开辟新途径。

拟解决的关键问题：

在细胞和整体动物水平，深入探讨O-GlcNAc糖基化系统的失衡对tau蛋白的O-GlcNAc糖基化、进而可能对它的磷酸化的影响，阐明tau蛋白的O-GlcNAc糖基化和磷酸化的相互关系，为AD发病机制提供新理论，为AD的预防和治疗提供理论依据。

3、本课题的特色和创新之处（与国内外类似研究比较）：

1）本项目基于申请者及国际同行相关研究的最新成果，提出tau蛋白的磷酸化O-GlcNAc糖基化的影响和调节的假说，其设计思路在国内外尚未见报道。

初次提出饥饿可能通过影响tau蛋白O-GlcNAc糖基化，进而引起tau蛋白AD样磷酸化。

项目如期完成，将给AD致病机制的探索和AD的防治提供新理念。

4、研究工作的预期结果、成果提交方式及专利申请状况

1）在细胞和整体动物水平阐述tau蛋白分子上O-GlcNAc糖基化和磷酸化的相互关系。

2）阐明O-GlcNAc糖基化在AD发病机理中的重要作用。

3）在被SCI收录的国内外核心期刊上发表3-5篇论文。

4）培养2－3名硕士研究生，2－3名年轻教师。

二、研究方法和技术路线：

1、拟采取的研究实验方法、步骤、技术路线及可行性、可靠性论证:

研究方法：

原代培养海马神经细胞、培养PC12细胞并用NGF诱导分化神经样细胞和培养SY5Y神经母细胞瘤细胞株，并用维甲酸诱导分化为神经样细胞。

UDP-GlcNAc含量测定：用过氯酸抽提、HPLC分离和紫外吸收定量。

OGT活性测定：用人工合成的9肽作为受体底物，用[3H]-UDP-GlcNAc作为供体底物，在一定的反应缓冲液中和一定的温度下反应，用Sep-Park Plus C18 柱分离反应产物和[3H]-UDP-GlcNAc，液闪测定放射性同位素的量，从而计算出OGT的活性。

O-GlcNAc糖基化的测定：用特异性抗O-GlcNAc糖基化的抗体或特异性识别O-GlcNAc糖基的凝集素和免疫印迹技术进行测定。用[3H]-UDP-半乳糖作供体底物，在半乳糖转移酶的催化下，末端为GlcNAc的糖链被标记上带同位素的半乳糖，用PNGase移去N-糖链，然后，将上述产物进行SDS-PAGE分离并放射自显影，通过图象分析系统，分析信号的强弱，从而判断O-GlcNAc糖基化的程度。

技术路线和实验方案：

常规培养海马细胞，PC12细胞和SY5Y细胞。

用低糖或无糖介质处理，或与葡萄糖胺联合处理细胞一定时间，检测tau蛋白的磷酸

化和AD样磷酸化位点；测定细胞内UDP-GlcNAc的水平；测定OGT的活性；测定细胞总蛋白的O-GlcNAc的程度；测定tau蛋白的O-GlcNAc程度。

用合成UDP-GlcNAc的限速酶谷氨酰胺-岩藻糖氨基转移酶的抑制剂……DON (6-diazo-5oxonorleucine)处理细胞，检测上述指标。

用O-GlcNAc糖苷酶的抑制剂STZ(streptozotocin)和PUGNAc处理细胞，检测脑组织中O-GlcNAc糖基化水平及tau 蛋白的磷酸化程度和AD样磷酸化位点。

转染技术，过表达O-GlcNAc，并用不同浓度的葡萄糖处理细胞，检测OGT活性、O-GlcNAc糖基化水平及tau蛋白的磷酸化程度和位点。

饥饿处理小鼠，复制AD样tau蛋白异常磷酸化模型，检测UDP-GlcNAc的水平、OGT的活性、总蛋白的O-GlcNAc糖基化程度和tau蛋白O-GlcNAc程度。

2、研究工作的总体安排及进度

2004.9－2006.9 葡萄糖最适浓度和处理时间，不同种培养细胞对引起AD样tau蛋白异常磷酸化的敏感性检测；建立和完善各种检测指标；检测“技术线路”中所述各项指标。