蛋白质相互作用研究方法

人类基因组序列测定工作的完成与结束标志着生物学研究已经进入后基因组研究时代。虽然在人类细胞中编码功能蛋白的基因并非想象的那么多（不到三万条），但是仅靠这些有限的基因就能组成并控制人类这样极其复杂有机体的生殖、生长、衰老与死亡，说明由遗传密码编码的这些有限的蛋白质的功能可能比人们想象的要复杂与精密。值得注意的是，我们现在往往忽视对于已知蛋白质功能进行新的探索。现在的情况是这样，一方面，已知蛋白的功能研究需要拓展；另一方面，新基因的功能需要探索。由此看来，研究手段显得非常重要。在蛋白质功能研究或蛋白质组学研究中，大多数研究者都采用蛋白质相互作用研究方法作为技术平台。这方面的文献日益增多。为什么蛋白质相互作用研究方法如此流行？原因之一就是“直接与明了”。在细胞内，所有蛋白在发挥作用时都不是孤立的，而是相互联系的，尤其在复杂的胞内信号转导网络体系中这种情况更为突出。一种蛋白的功能必须借助于其它蛋白的调节或介导。这种调节或介导作用的实现首先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。如果找到与已知蛋白有相互作用的其它蛋白（不管这种蛋白是已知的还是未知的），那么这种已知蛋白的功能研究有可能进入一个新的天地。对于新基因情况也是如此。一般普遍认为，新基因的研究往往令人感觉无从下手。但实际上情况并非如此，现有的各种技术与方法总能使我们找到研究的切入点。首先我们可以通过在结构上寻找功能提示，再在实验中进行验证。在新基因的研究中，蛋白质相互作用研究方法也是必不可少的。但是方法毕竟是方法，一旦确定了蛋白质之间有相互作用就要进行功能研究。本文对目前文献上报道的各种蛋白质相互作用研究方法进行介绍与总结。

1， 酵母双杂交1-5

酵母双杂交的原理是，把报告基因HIS3和lacZ整合到酵母细胞基因组中，并受转录因子 GAL4的表达。一旦GAL4蛋白结合到HIS3和lacZ序列相应的位点，则启动报告基因的表达。通过检测报告基因的表达判断阳性或阴性。实际应用中，把GAL4基因分成两个部分：DNA结合区（gal4 DNA binding domain, GBD）和激活区(gal4 activating domain, GAD）。分别把GBD和GAD构建到两个不同的载体上，并能表达相应的两个融合蛋白（GBD-X和GAD-Y）。然后把GBD-X和GAD-Y两种载体共转染到带有报告基因的酵母细胞中。当GBD-X融合蛋白中X蛋白与GAD-Y融合蛋白中Y蛋白发生相互作用时（或结合在一起时），就使得原本分开的GBD和GAD蛋白靠近并具有完整的GAL4蛋白的功能，从而能够激活报告基因的表达。

（1） 筛选相互作用的蛋白

酵母双杂交技术能用于对cDNA 文库的筛选。把你要研究的蛋白亚克隆到GBD载体上，作为“诱饵”蛋白。把文库蛋白基因亚克隆到GAD载体上。然后就可以在文库中寻找那些能够与“诱饵”蛋白可以相互作用的蛋白。也许你能够筛选到多株阳性克隆。虽然酵母双杂交技

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术具有广泛的应用价值，但正如任何其它技术一样，酵母双杂交技术也有一定的局限性。酵母双杂交技术最大的弱点就是假阳性出现率。所以筛选到的阳性克隆需要进一步的鉴定和功能数据支持。

（2） 确定参与结合作用的结构域或motif

当你确定了两个蛋白质分子之间有相互作用后，利用酵母双杂交技术可以精细研究蛋白质分子中那些结构起结合调节作用。你可以先把一个蛋白进行随机缺失，制备一系列缺失体，然后来检测这些缺失体与另一个蛋白质结合力的大小，直到发现在蛋白质两两分子间起决定作用的氨基酸序列（称为结构域或motif）。如果一个蛋白分子中具有已知的结构域或motif，也一样进行缺失，看是否这些已知的结构域或motif参与结合调节作用。有的情况下蛋白质相互作用可能与蛋白质的磷酸化状态有关。这时就需要对可能的磷酸化位点进行点突变，检测这些磷酸化位点是否参与调节蛋白质的结合作用。

2， GST沉淀实验（GST-pull down实验）（细胞外蛋白质相互作用）

5-11

上面提到，用酵母双杂交方法筛选到的蛋白需要作进一步的鉴定。鉴定方法之一就是GST沉淀实验。GST沉淀实验主要是用来证明蛋白质胞外的相互作用。蛋白质在胞外的相互作用排除了酵母细胞内复杂体系的干扰，，比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物理的相互作用。同酵母双杂交实验一样，运用此法也可以证明相互作用的蛋白分子中是否有参与调节作用的结构域或motif。GST沉淀实验原理就是，把你要研究的蛋白基因亚克隆到带有GST（谷胱甘肽转移酶）基因的原核表达载体中，并在细菌中表达GST融合蛋白（GST-X）。把GST融合蛋白挂到带有GST地物的Sepharose beads上，然后把另一种蛋（Y）白加入其中。由于蛋白质之间的结合作用，形成了这样的复合物：GST-X----Y。这一复合物与固体支持物（Sepharose beads）又结合在一起，可以被沉淀下来。此法又有在不同情况下的具体应用，以下一一作介绍。 （1） GST融合蛋白与重组蛋白的相互作用

GST融合蛋白是在原核表达的，所以没有经过过多的象真核细胞内具有的蛋白修饰作用。所以另一种用来检验相互作用的蛋白也可以用原核表达出来，也就是所谓的重组蛋白。当GST融合蛋白把重组蛋白沉淀下来，然后用重组蛋白的抗体作Western blotting检测。 （2） GST融合蛋白与体外TNT系统合成的多肽或蛋白的相互作用

用来检验与GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用TNT体外蛋白合成体系进行合成，并且还可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便于检测的标签。GST融合蛋白沉淀下来的蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽的抗体或标签抗体进行Western blotting检测。如果蛋白之间结合力非常弱，用Western blotting检测方法难以检测到，你可以在TNT体外合成时给蛋白进行同位素（S32）标记。这样沉淀下来的蛋白进行放射自显影，检测灵敏度将极大提高。 （3） GST融合蛋白与细胞内源性蛋白质的相互作用

GST融合蛋白还可以把细胞提取物中有相互作用的内源性蛋白质沉淀下来。如果内源性蛋

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白含量低或结合力弱，可以采用脉冲法使细胞在某一段时间内合成的所有蛋白质都标记上放射，然后提取细胞总蛋白与GST融合蛋白温育。GST融合蛋白沉淀下的带有放射性性同位素（S32）

标记的蛋白跑电泳，进行放射自显影。

（4） GST融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质的相互作用

当内源性蛋白质含量低，并且有可能影响蛋白质的相互作用，也可以把该蛋白的基因转染到靶细胞内进行过表达，然后检验蛋白质相互作用。

（5） GST融合蛋白与待测蛋白的相互作用有可能与待测蛋白的磷酸化状态有关

在进行GST沉淀实验时，有时也会遇到比较复杂的情况，具体情况具体分析，分别对待。比如，两个蛋白质之间发生相互作用时有可能与蛋白磷酸化状态有关。或者蛋白首先被磷酸化后方能产生相互作用，或者磷酸化的蛋白必需脱磷酸化后才能产生相互作用。如果你确实在你的实验中发现了其中一种情况，这将是一个非常有意义的结果。

3， 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation ）（细胞内蛋白质相互作用）9-16

免疫共沉淀技术用来证明蛋白质在胞内是否有相互作用。一般来说，两种蛋白在细胞内发生相互作用时会形成两种蛋白的复合物，这样就可以先用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来，然后用另一种蛋白的抗体进行Western blotting检测，看两种蛋白之间是否确实形成免疫复合物，并能与protein A/G agarose一起沉淀下来。免疫共沉淀原理简单，但技术极为复杂。因为细胞内蛋白种类繁多，制约因素多。如果两种蛋白之间可以发生相互作用，并不是这两种蛋白所有分子都参与结合作用，也可能只有极少部分蛋白分子结合在一起（足以满足细胞功能需要）。在提取细胞蛋白时，如果条件不当就会破坏两种相互作用蛋白形成的复合物的稳定性，使得免疫共沉淀实验失败。如果两种蛋白在细胞内的结合力确实非常弱，那么免疫共沉淀也难以成功。如果知道发生相互作用的两个蛋白都是胞核蛋白，那么可以通过提取核蛋白，再进行免疫共沉淀实验，这样会大大减低背景的干扰。关于两种蛋白质之间胞内的相互作用，有时确实无法用免疫共沉淀实验证明。

（1） 细胞内过表达蛋白的免疫共沉淀

证明蛋白质胞内相互作用时，可以选择一个高效瞬时过表达系统（至于这一系统是否有内源性靶蛋白无关紧要）。一般采取COS细胞作为真核表达株。把两种蛋白基因共转染到COS细胞内进行表达。由于人为进行大量表达，所以在胞内两种蛋白形成相互作用的复合物的量也相应增多。如果你手头没有这两种蛋白的抗体，可以把这两种蛋白的一端分别加上标签以融合蛋白形式表达，然后用商业化的抗标签抗体进行免疫共沉淀和Western blotting检测。 （2） 细胞内源性蛋白的免疫共沉淀

把两种蛋白共转染到COS细胞内进行过表达，进行免疫共沉淀实验，相对容易成功，但是这一结果毕竟具有人工性，不能代表生理条件下真实的蛋白质相互作用。要想克服这一弱点，可以做内源性的免疫共沉淀实验。这一技术要求极高，难度极大，但也最有说服力。因为细胞内内源性蛋白含量低，结合在一起形成复合物的量更低，难以检测。首先要证明所选择的细胞

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系是否具有这两种内源性的蛋白。另外，用于免疫沉淀和Western blotting检测的抗体要好。细胞裂解、收集以及免疫沉淀时时条件要温和，以保持蛋白复合物的天然结构。 （3） 组织内蛋白的免疫共沉淀

在体外可以大量培养细胞，然后制备细胞提取物，做内源性免疫共沉淀。由此可以推广到做组织内免疫共沉淀。取动物组织（脑、肝、脾等），切碎，匀浆，提取组织蛋白，进行免疫共沉淀实验。这一结果代表活体中蛋白质相互作用。 4， 蛋白质细胞内定位实验17-22

另一种经常用来检验蛋白质相互作用的方法是蛋白质细胞内定位技术。此法较为直观，可以看到两种有相互作用的蛋白质在细胞内的分布（膜上、胞浆、胞核或其它细胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞浆中某一部位或核内共定位等等）。有时相互作用的蛋白由于细胞内某种功能的需要结合在一起时，使得两种蛋白的分布发生变化。比如，某种蛋白也许在核内，当它与另一种具有穿梭功能的蛋白结合时，有可能被转运到胞浆中。这种情况的共定位则较为典型。在进行蛋白质共定位

（1） 利用有色荧光蛋白标记技术进行蛋白定位研究

此法也可称为活细胞定位。把两种具有相互作用的蛋白分别克隆到带有两种不同颜色荧光蛋白（绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白）的载体中，共转染到功能细胞中（一般选用COS7细胞）表达带有荧光的融合蛋白。这样，相互作用的两种蛋白就被标上不同的荧光，可以在细胞内用荧光显微镜直接观测。在进行精确细胞定位或共定位时，必须用共聚焦荧光显微镜观测。因为共聚焦荧光显微镜（相当于医院给病人诊断的CT）观测的是细胞内一个切面上的颜色。如果在一个切面上在同一区域看到两种颜色，就提示这两种蛋白在该区域内有相互作用。普通荧光显微镜看到的是一个立体图象，无法确定蛋白质共定位现象。在进行定位或共定位同时，也可以对细胞核进行染色。这样，在细胞中就有三种颜色。细胞核的显色帮助你确定共定位发生的位置。

上面介绍的活细胞定位，其优点是表达的荧光蛋白荧光强，没有背景，观测方便。但缺点是相互作用的蛋白由于标上荧光蛋白，实际上是两个融合蛋白。融合蛋白的定位结果或共定位结果是否与天然蛋白分布一致，有待于进一步确定。而利用免疫荧光标记技术可以避免这一缺点。

（2） 利用双色或多色染色的免疫荧光技术进行蛋白定位研究

免疫荧光的原理是，首先把细胞进行固定，然后用待检测靶蛋白的抗体（一抗）与细胞内靶蛋白进行免疫反应，再用荧光素（如FITC和TRITC等）标记的二抗与一抗进行反应。这样就在细胞内形成免疫复合物（靶蛋白----一抗---二抗），结果靶蛋白被标上颜色，然后可用共聚焦荧光显微镜观测定位与共定位结果。

免疫荧光技术最大优点就是可用来检测细胞内源性蛋白的定位及相互作用。当然也可以对靶细胞进行转染表达目的蛋白，然后标记目的蛋白进行观测。免疫荧光技术的缺点是荧光相对

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较弱并且背景较高，结果受到干扰，所以这项技术不好掌握。为了结果的可靠性，要求严格设计阳性对照与阴性对照。 （3） 细胞内蛋白动态定位

有时细胞在正常状态下，有相互作用的蛋白在胞内可能暂时分开，没有共定位现象发生。但是在某一个特定情况下，如细胞受到外界刺激时，细胞本身会产生应急反应，这时暂时分离的蛋白有可能发生相互作用，并产生共定位现象。所以在进行共定位研究时，可根据具体情况具体分析，必要时观测细胞内蛋白动态定位结果。 参考文献

1， Yang, M., Wu, Z., Fields, S. Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system. Nucleic Acids Research. 23(7), 1152-1156(1995).

2， Young, K.H. Yeast Two-Hybrid: So Many Interactions, (in) So Little Time. Biology of Reproduction 58,302-311(1998).

3， Zhang, Z., Hong, Z., Verma, D.P.S. Phragmoplastin polymerizes into spiral coiled structures via intermolecular interaction of two slf-assembly domains. J. Biol. Chem. 275(12), 8779-8784(2000). 4， Frederickson, R.M. Macromolecular matchmaking: advances in two-hybrid and related technologies. Current Opinion in Biotechnology. 9,90-96(1998).

5， Fields, S., Sternglanz, R. The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions. TIG. 10(8), 286-292(1994).

6， Lucet, I., Feucht A., Yudkin, M.D., Errington, J. Direct interaction between the cell division protein FtsZ and the cell differentiation protein SpoIIE. The EMBO Journal. 19(7), 1467-1475(2000).

7， Schmandt, R., Liu, S.K., McGlade, C.J. Cloning and characterization of mPAL, a novel Shc SH2 domain-binding protein expressed in proliferating cells. Oncogene. 18, 1867-1879(1999).

8， Dechend, R., Hirano, F., Lehmann, K., Heissmeyers, V., Ansieau, S. The Bcl-3 oncoprotein acts as a bridging factor between NF-kB/Rel and nuclear co-regulators. Oncogene. 18, 3316-3323(1999).

9， Tomita, S., Kirono, Y., Suzuki, T. A basic amino acids in the cytoplasmic domain of Alzheimer’s β-Amyloid precursor protein(APP) is essential for cleavage of APP at the a-site. J. Biol. Chem. 273(30), 19304-19310(1998).

10， Jones, N., Dumont, D. The Tek/Tie2 receptor signals through a novel Dok-related docking protein, Dok-R. Oncogene. 17, 1097-1108(1998).

11， Seeger, M., Kraft, R., Ferrel, K., Naumann, M., Dubiel, W. A novel protein complex involved in signal transduction possessing similarities to 26S proteasome subunits. FASEb J. 12,

95

469-478(1998).

12， Kawabuchi, M., Satomi, Y., Takao, T., Shimonishi, Y., Okada, M. Transmembrane phosphoprotein Cbp regulates the activities of Scr-family tyrosine kinases. Nature. 404, 999-1003(2000).

13， Kong, M., Barnes, E.A., Ollendorff, V., Donoghue, D.J. Cyclin F regulates the nuclear localization of cyclin B1 through a cyclin-cyclin interaction. The EMBO J. 19(6), 1378-1388(2000).

14， Bianchi, E., Denti, S., Granata, A., Rogge, L., Pardi, R. Nature. 404, 617-621(2000).

15， Tomoda, K., Kubota, Y., Kato, J. Degradation of the cyclin-dependent-kinase inhibitor p27kip1 is instigated by Jab1. Nature. 398, 160-1(1999).

16， Tomita, S., Ozaki, T., Taru, H., Yagi, Y., Kirino, Y., Suzuki, T. Interaction of a Neuron-specific protein containing PDZ domains with Alzheimer’s Amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 274(4), 2243-22(1999).

17， Zamir, I., Dawson, J., Lavinsky, R., Glass, C.K., Rosenfield, M.G., Lazar, M.A. Cloning and characterization of a corepressor and potential component of the nuclear hormone receptor repression complex. . Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 14400-14405(1997).

18， Li, S., Liu, X., Ascoli, M. P38JAB1 binds to the intracellular precursor of the Lutropin.Choriogonadotropin receptor and promotes its degradation. J. Biol. Chem. 275(18), 13386-13393(2000).

19， Hiota, K., Matsui, M., Iwata, S., Nishiyama, A., Mori, K., Yodoi, J. AP-1 transcriptional activity is regulated by a direct association between thioredoxin and Ref-1. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 3633-3638(1997).

20， Lee, C., Chinpaisal, C., Wei, L. Cloning and Characterization of mouse RIP140, a corepressor for nuclear orphan receptor TR2. Mol. Cell. Biol. 18(11), 6745-6755(1998).

21， Aronheim, A., Zandi, E., Hennemann, H., Elledge, S.J., Karin, M. Isolation of an AP-1 repressor by a novel method for detecting protein-protein interactions. Mol. Cell. Biol. 17(6), 3094-3102(1997).

22， Dressel, U., Thormeyer, D., Renkawitz, R., Baniamad, A. Alien, a highly conserved protein with characteristics of a corepressor for membranes of the nuclear hormone receptor superfamily. Mol. Cell. Biol. 19(5), 3383-3394(1999).

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